纤连蛋白Ⅲ型结构域蛋白5对HepG2肝癌细胞体外转移活性的影响及其机制

袁庆功 张焱 李军辉 杨文彬

肝癌发生过程包含了遗传/表观遗传改变以及细胞分子路径的失调,Wnt/β-catenin途径在肝癌中通常上调,与维持肿瘤起始细胞、耐药性、肿瘤进展和转移密切相关[1,2]。因此,开发针对Wnt/β-catenin途径的选择性药物对于肝细胞癌治疗具有重要意义。纤连蛋白Ⅲ型结构域蛋白5(fibronectin type III domain containing 5, FNDC5)一种脂肪因子,最初在骨骼肌和脂肪组织中发现,在代谢紊乱、宫颈癌、子宫内膜癌、癌症恶病质和妊娠前期糖尿病患者中表达降低[3]。本研究探索FNDC5在肝细胞癌发展中的作用机制,以期为肝细胞癌的治疗提供思路。

材料与方法

一、材料与仪器

肝癌细胞系HepG2细胞(上海中国科学院细胞资源中心);重组人FNDC5蛋白(英国Abcam公司);RPMI-1640培养基(北京依诺凯公司);RIPA裂解液(武汉卡诺斯公司);Annexin V/PI试剂盒(北京普利莱公司);青霉素-链霉素双抗(上海莱尔公司);BCA试剂盒(美国Applied Biosystems公司);结晶紫指示剂、Matrigel(南京Vazyme公司)。Anti-β-actin(武汉Proteintech Group公司);anti-C-myc(英国Abcam公司);Cyclin-D1(美国Santa cruz公司)。细胞培养箱(美国赛默飞公司);酶标仪(中国普朗公司);荧光显微镜(中国复享光学公司);凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司);流式细胞仪(深圳迈瑞公司)。

二、方法

(一)细胞培养 在37 ℃、体积分数为0.05的CO2环境中,RPMI 1640培养基(10%胎牛血清)培养,同时加入双抗(青霉素-链霉素)混合溶液,然后收集生长状态良好的细胞并将细胞分为4组,分别用0、5、10、20 μmol的重组人FNDC5蛋白处理HepG2细胞12 h。

(二)噻唑蓝检测细胞活力 将细胞培养在96孔板中,每孔3×103个细胞,培养12 h,使用0、5、10、20 μmol的重组人FNDC5蛋白培养,加入20 mL MTT液(5.0 mg/mL),37 ℃培养4 h,用100 mL二甲基亚砜溶解紫色晶体,Mitras2LB943多功能酶标仪分别在于0、12、24、48 h检测各组细胞的吸光度(490 nm),统计细胞存活率。

(三)细胞划痕实验分析细胞迁移能力 在6孔板培养细胞,加入重组人FNDC5蛋白,将100 μL的枪头在细胞中划痕,使划痕的大小一致。对该线进行拍照、标记,并在37℃下培养24 h。PBS清洗3次细胞,显微镜下观察统计迁移细胞数。

(四)Transwell实验分析细胞侵袭能力 将1×105个细胞添加到涂有Matrigel的上腔中。同时把10% FBS 500 μL RPMI 1640培养液加入到下室。隔夜孵化后,除去未贴壁的多余细胞。4%多聚甲醛固定,通过结晶紫对细胞进行染色。显微镜对五个任意挑选的区域内的细胞数量进行计数。

(五)流式细胞术分析细胞凋亡率 将细胞离心并用预冷75%乙醇再次悬浮。450 μL PBS补充50 μL碘化丙(0.5 mg/mL)重新悬浮细胞, 37 ℃培养30 min。5 μL Annexin-V-异硫氰酸荧光素孵育细胞。流式细胞仪检测凋亡细胞。

(六)集落形成实验分析细胞生长能力 HepG2细胞接种到6孔板,1×102个细胞/孔,在培养箱中继续放置14 d,4%多聚甲醛固定,PBS清洗后,加入结晶紫对细胞进行染色,显微镜下计数细胞集落数。

(七)蛋白免疫印迹分析Wnt/β-catenin通路蛋白的影响 在4℃环境下将RIPA裂解液加入培养皿裂解细胞,离心收集总蛋白。BCA试剂盒计算各组总蛋白质的浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白,截取含目的蛋白的凝胶电转到PVDF膜。在室温环境中,用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1.5 h。与对应的一级抗体4 ℃过夜。次日用辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG抗体将PVDF膜孵育1 h。用增强化学发光试剂盒使蛋白显影,Image Lab软件计算灰度值。

三、统计学分析

结 果

一、FNDC5对HepG2细胞生长的作用

MTT实验结果表明,经0、5、10和20 μmol的FNDC5处理的HepG2细胞,其存活率分别为92.86±0.32、79.32±0.17、50.11±0.56和29.29±0.96,差异有统计学意义(F=23.897,P=0.003)。在20 μmol的FNDC5浓度下,处理0、12、24和48 h后,HepG2细胞的存活率分别为95.66±0.72、32.56±0.93、22.17±0.29和13.66±0.91,差异有统计学意义(F=25.321,P=0.001)。

二、不同浓度FNDC5对HepG2细胞侵袭与迁移能力的作用

见表1。划痕结果显示,各个浓度的重组FNDC5蛋白能够抑制HepG2细胞迁移,同时随着重组FNDC5蛋白的浓度升高,其抑制效果也逐渐加强,见图1A。此外,Transwell的结果显示,各个浓度的重组FNDC5蛋白能够抑制HepG2细胞侵袭,同时随着重组FNDC5蛋白浓度加大,抑制作用加强,见图1B。

A为划痕实验结果;B为细胞侵袭实验结果。

表1 不同浓度FNDC5对HepG2细胞迁移和侵袭的影响(±s)

三、不同浓度FNDC5对HepG2凋亡的影响

流式细胞术分析发现,不同浓度重组FNDC5蛋白能够促进HepG2细胞的凋亡发生。同时重组FNDC5蛋白浓度升高,HepG2细胞的凋亡比例也伴随增加,见图2。

图2 不同浓度FNDC5对HepG2凋亡的影响

四、不同浓度FNDC5对HepG2细胞集落形成的影响

细胞集落形成实验发现,不同浓度重组FNDC5蛋白能够抑制HepG2细胞的集落形成,同时重组FNDC5蛋白浓度升高后,HepG2细胞的集落数量也随之减少,见图3,表2。

图3 浓度FNDC5对HepG2细胞集落形成的影响

表2 不同浓度FNDC5对HepG2细胞集落形成和凋亡的影响(±s)

五、不同浓度重组FNDC5蛋白对Wnt/β-catenin通路的作用

Western blotting实验发现,不同浓度FNDC5对Wnt/β-catenin通路具有抑制作用,且随着FNDC5浓度增加,β-catenin、C-myc和Cyclin-D1蛋白表达逐渐降低,见图4,表3。

图4 不同浓度FNDC5对Wnt/β-catenin通路的影响

表3 不同浓度FNDC5对Wnt/β-catenin通路的影响(±s)

讨 论

肝癌患者的预后主要取决于术后复发和残留肝实质浸润性转移的发生率,侵袭和转移是肝癌的基本特征[4-6]。研究发现,肝癌患者肝组织中FNDC5的异常表达与癌症相关[7]。然而,FNDC5过度表达对HepG2细胞生长和转移的影响因素尚不清楚。FNDC5除了与肝细胞癌密切相关之外,也能够减弱MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞的生长活性和转移能力[8,9]。然而,在子宫内膜癌、结肠癌、甲状腺癌和食管癌,细胞体外与对照样品中的发现相比,FNDC5对细胞增殖、粘附或集落形成没有影响[10]。本研究的结果表明,不同浓度FNDC5可抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和集落形成,并促进肝癌细胞凋亡;除此之外,发现FNDC5的作用与Wnt/β-catenin通路相关,不同浓度FNDC5能够抑制Wnt/β-catenin通路中β-catenin、C-myc和Cyclin-D1蛋白的表达。

研究表明,Wnt/β-catenin通路参与多种癌症的发展,包括胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌和肝癌[11]。Wnt/β-catenin还能够影响下游其他蛋白的活性,包括mTOR、NF-κB、P70S6K和Bax,以调节细胞增殖和迁移[12]。降低Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达水平有利于阻止HCC细胞增殖和侵袭,但是上调Wnt/β-catenin通路后可以促进HCC细胞生长活性、侵袭、克隆形成和肿瘤形成[13]。体外研究发现,β-catenin在肝癌组织和肝癌细胞中的表达增加,在肝癌的发展和进展中至关重要[14]。本研究证明,FNDC5显著降低HepG2细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的活性。采用FNDC5处理HepG2细胞后,β-catenin、C-myc和Cyclin-D1蛋白的表达水平下降,细胞增殖、迁移和侵袭也下降,凋亡增加,表明Wnt/β-catenin通路参与了FNDC5对HepG2细胞增殖、迁移和侵袭抑制过程。

综上所述, FNDC5可以抑制肝癌细胞的生长活性、迁移、侵袭和集落形成,并促进肝癌细胞凋亡;进一步证明了FNDC5能够下调Wnt/β-catenin通路的活性,进而抑制肝癌的恶性发展。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。