原发性肝癌根治术后恶性胸腹水患者T淋巴细胞及NK细胞水平观察

李姣姣 赵永昌 武军霞

原发性肝癌发病率在世界各国常见恶性肿瘤中位居前列,同时原发性肝癌也是癌症死亡的第2大原因[1]。外科治疗如射频消融术、肝癌根治术等是原发性肝癌患者延长生存时间的重要方法,随着精准肝切除技术的发展和应用,护理水平的提高,肝癌根治术的价值越来越受到重视[2-3]。恶性胸腹水是肝癌切除术后的常见并发症,胸腹水不仅增加患者的痛苦、影响患者的康复,严重时还可能引起呼吸衰竭、肺部感染甚至威胁患者生命,并增加其经济负担[4-5]。目前国内有关恶性胸腹水的研究较少,但有报道指出恶性胸腹水患者存在明显的免疫抑制,自然杀伤(Natural killer, NK)细胞具有识别和清除变异细胞的作用,可用于肿瘤监视[6-7]。本研究纳入100例原发性肝癌根治术后胸腹水患者,观察胸腹水T淋巴细胞及NK细胞水平并探究其临床意义。

资料与方法

一、一般资料

陕西省榆林市第二医院收治的100例原发性肝癌根治术后胸腹水患者,纳入时间2019年3月—2022年3月,男性58例、女性42例;年龄34～58岁,平均(44.1±8.8)岁。患者均符合原发性肝癌相关诊断标准[8]。排除标准:①合并严重心、肾等器官功能障碍;②合并神经、免疫及血液系统疾病;③预计生存时间不足3个月;④妊娠或哺乳期妇女;⑤凝血功能障碍。胸腹水标本经细胞学检查检出恶性肿瘤细胞,穿刺活检或手术病理学诊断为恶性肿瘤,符合其中任意一条则诊断为恶性胸腹水,不符合任意一条则诊断为非恶性胸腹水,根据胸腹水良恶性将患者分为恶性组(24例)和非恶性组(76例)。患者及家属知情同意,研究获得本院伦理委员会批准(2019-23号)。

二、指标检测

采集患者胸腹水5 mL,将其置于肝素抗凝管中保存,上下颠倒使之混合均匀,之后在30 min内处理标本。另取一支流式管,分别向其中加入CD3、CD4、CD8(鼠抗人单克隆抗体,均购自上海信裕伊赫生物科技有限公司),各10 μL,已经过荧光素标记,之后取胸腹水标本700 μL加入流式管中,混合均匀后,在避光、室温环境下孵育1 h。对肝素抗凝管中余下的胸腹水进行离心处理。将红细胞裂解液和三蒸水以1∶9的比例进行配制,将配置完成的红细胞裂解液1000 μL加入流式管中,10 min混匀,离心后去上清液,将管口吸干。向流式管中加入PBS缓冲液3 mL,混合均匀后在室温环境下离心处理,离心后去上清液,将管口吸干。最后将300 μL PBS缓冲液加入流式管中,立即送检,使用贝克曼FC500流式细胞仪检测胸腹水CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+表达。收集胸腹水单个核细胞于1.5 mL灭菌EP管中,离心后去上清,加入培养基、重悬,之后依次进行细胞培养、收获、质控,并检测NK细胞表达。

三、统计学分析

结 果

一、两组T淋巴细胞亚群与NK细胞水平比较

与非恶性组相比,恶性组CD3+、CD3+CD4+、NK细胞水平较低,CD3+CD8+细胞水平较高(P<0.05),见表1。原发性肝癌根治术后恶性胸腹水、非恶性胸腹水CT图像见图1。

A:原发性肝癌根治术后恶性胸腹水CT图像,B:原发性肝癌根治术后非恶性胸腹水CT图像

表1 两组T淋巴细胞亚群与NK细胞水平(±s)比较

二、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK细胞水平诊断原发性肝癌根治术后恶性胸腹水的ROC分析

经ROC分析,CD3+≤69.2%、CD3+CD4+≤70.8%、CD3+CD8+≥31.5%、NK≤22.1%是原发性肝癌根治术后恶性胸腹水的最佳截断值(P<0.05,表2);CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK细胞水平诊断原发性肝癌根治术后恶性胸腹水的ROC曲线见图2。

图2 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK细胞水平诊断原发性肝癌根治术后恶性胸腹水的ROC曲线

表2 CD3+、CD3+CD8+、NK细胞水平诊断原发性肝癌根治术后恶性胸腹水的ROC分析

三、原发性肝癌根治术后恶性胸腹水风险与T淋巴细胞亚群及NK细胞水平的相关性分析

原发性肝癌根治术后恶性胸腹水风险与CD3+、CD3+CD4+、NK细胞水平成负相关(r=-0.625、r=-0.517、r=-0.573,P<0.05),与CD3+CD8+水平呈正相关(r=0.582,P<0.05)。

讨 论

作为恶性肿瘤的一种常见并发症,恶性胸腹水也是许多中晚期癌症患者的常见临床表现,也是恶性肿瘤远处转移的常见表现[9-11]。T淋巴细胞和NK细胞是机体天然免疫系统的重要细胞,在机体识别和清除肿瘤细胞方面具有重要作用,胸腹水中通常聚集了大量淋巴细胞,主要为CD4+T细胞亚群,而NK细胞也参与了胸腹水的发生和发展[12-13]。

本研究结果显示,与非恶性组相比,恶性组CD3+、CD3+CD4+、NK细胞水平较低,CD3+CD8+细胞水平较高,提示与非恶性胸腹水患者相比,恶性胸腹水患者存在严重T淋巴细亚群失调。T淋巴细胞在机体免疫应答的负调节和患者自身免疫耐受中具有关键作用[14]。T淋巴细胞亚群中CD4+、CD8+在抗肿瘤免疫中具有不同的作用。CD4+能够同时诱发自身免疫、产生肿瘤免疫。CD8+具有杀伤作用,直接接触到肿瘤细胞后,CD8+能够释放细胞毒性物质,如颗粒酶、穿孔素等,这些毒性物质可作用于靶细胞使之发生溶解,CD8+释放的细胞因子还能在一定程度上诱导靶细胞凋亡[15]。恶性胸腹水是其他部位肿瘤向胸腹膜转移或肿瘤直接侵袭胸腹膜造成,胸腹水中通常存在大量CD4+细胞,辅助T淋巴细胞1(Helper T lymphocyte 1, Th1)的抗肿瘤免疫作用主要是通过大量释放γ干扰素(Interferon-γ, IFN-γ)实现的[16]。研究显示[17],与结核性胸腹水相比,恶性胸腹水中IFN-γ的表达水平显著较低,结核性胸腹水微环境的免疫应答接近Th1类淋巴细胞,有利于清除病原菌。与之相比,恶性胸腹水患者虽然受到肿瘤相关炎症的影响也存在CD4+细胞聚集情况,但更倾向于Th2类,未能充分发挥CD4+细胞的免疫功能,为肿瘤细胞的侵袭和逃避免疫识别创造了条件。

NK细胞在过去的研究中多被用于各种肝细胞癌、肝炎的诊断和鉴别,能用于反映患者的细胞免疫平衡状态。此外,作为一种广谱杀伤性细胞,NK细胞具有识别并清除变异细胞的作用,但许多研究显示[18-19],原发性肝癌等肿瘤患者机体中的NK细胞功能多处于受损状态,因此NK细胞的功能减弱多被认为是肿瘤发生和进展的原因之一。NK细胞中CD56dimNK亚群是发挥细胞毒性功能的主体,本研究中恶性胸腹水的NK细胞比例低于非恶性胸腹水,其原因可能为CD56dimNK亚群的比例降低,并且CD56dimNK亚群比例降低也是恶性胸腹水患者免疫功能减弱的原因之一。

综上,原发性肝癌根治术后恶性胸腹水患者存在明显的免疫功能低下,主要表现为CD3+、CD3+CD4+、NK细胞比例的下调和CD3+CD8+细胞比例的上调,原发性肝癌患者发生恶性胸腹水的风险越高,此外与非恶性胸腹水相比,恶性胸腹水免疫功能紊乱更严重,临床可参考以上指标对恶性胸腹水进行筛查。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。