红豆杉枝枯病病原鉴定及杀菌剂室内毒力测定

乔雨晴 ， 李媛 ， 罗国安 ， 徐燕婷 ， 汪天娜 ， 苏秀

（1. 浙江农林大学林业与生物技术学院, 浙江 杭州 311300； 2. 余姚市林业服务中心, 浙江 余姚 315400； 3. 景宁畲族自治县沙湾镇人民政府, 浙江 景宁 323507； 4. 杭州市临安区植物检疫站, 浙江 杭州 311300）

曼地亚红豆杉Taxus×media是东北红豆杉Taxus cuspidata和欧洲红豆杉Taxusbaccata的杂交种，其植物学特征介于双亲之间，生长速度快，生物学特性稳定。自20 世纪90 年代我国引种后，现已在各地广泛栽植。曼地亚红豆杉体内紫杉醇含量较高，药用价值极高[1-2]，同时也具有较高的生态价值，对环境适应能力较强，可广泛应用于水土保持林、水源涵养林[3]。

曼地亚红豆杉常见病害主要有红豆杉茎腐病、红豆杉白绢病、红豆杉炭疽病等[4-5]。枝枯病是近年来日益严重的病害，其病原侵染性强，病害蔓延迅速，常导致枝条枯死，严重时可造成大面积植株死亡。在杭州临安、余杭等地，曼地亚红豆杉枝枯病发病较为普遍，严重地区发病率可达80%左右，造成巨大的经济和生态损失。目前，曼地亚红豆杉枝枯病病原尚未明确，影响了病害的科学防控。

本研究对采集于浙江临安的曼地亚红豆杉枝枯病病样进行组织分离，基于病原形态学、致病性和分子序列特征对病原进行了鉴定，并采用菌丝生长速率法测定了6 种常用杀菌剂的毒力，以期为该病害的科学诊断与有效防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2020 年10 月，从临安区潜川镇银福红豆杉基地采集曼地亚红豆杉枝枯病病枝，用于组织分离、纯化和培养。同时，将基地中采集的3 a 生健康曼地亚红豆杉树苗，置于25 ℃恒温培养室培养用于接种。

选择常用的6 种杀菌剂作为供试药剂。50%多菌灵可湿性粉剂（WP），安徽华星化工有限公司；250 g/L 吡唑醚菌酯乳油（EC），巴斯夫植物保护有限公司；75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂（WG），拜耳股份公司；60%吡唑醚菌酯·代森联WG，巴斯夫欧洲公司；48%苯甲·嘧菌酯悬浮剂（SC），惠州银农科技股份有限公司；啶氧菌酯SC，美国杜邦公司。

1.2 病原菌的分离鉴定

选取发病枝条病健交界组织采用组织分离法进行病原菌分离纯化[6]，直至获得纯培养物。制作临时玻片，参照蔡磊 等[7]的方法通过光学显微镜观察病原菌形态和培养特征。采用创伤接种法将分离纯化得到的菌株接种至健康树苗侧枝部位，测定其致病性。采用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的真菌基因组DNA 快速抽提试剂盒提取分离菌株总DNA，进行rDNA-ITS、β-tubulin、tef1基因序列的PCR 扩增，具体反应体系和扩增条件均参照石凌波[8]的方法进行。rDNA-ITS 的PCR 扩增引物为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[9]，βtubulin引物为Bt2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）和Bt2b（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）[10]，tef1扩增引物为EF1-526F（5′-GTCGTYGTYATYGGHCAYGT-3′）和EF1-1567R（5′-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3′）[11]。取PCR 产物5 μL，采用1%琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否单一清晰，切胶回收后送公司测序。将测序结果提交至NCBI 数据库，经BLAST 数据分析后，选取合适的参比菌株的基因序列，采用MEGA7 软件进行同源性分析，对串联后的序列基于邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树。

1.3 药剂室内毒力测定

采用菌丝生长速率法[12]测定6 种杀菌剂对病原菌的毒力。50%多菌灵WP 的质量浓度梯度为0.5，0.4，0.3，0.2，0.1 mg/L，其他药剂的质量浓度梯度均为8，4，2，1，0.5，0.25 mg/L。配制不同质量浓度的含药PDA 平板。取培养4 d 的病原菌菌落，用打孔器取直径7 mm 的菌饼，将菌饼分别接种在含有不同质量浓度药剂的PDA 培养基上，以加入清水的培养基作为对照。每个处理重复3 次。接种病原菌后将培养皿倒置放于25 ℃恒温培养箱黑暗培养，待对照组菌丝长至培养皿的2/3 后，用十字交叉法测量菌落直径。

1.4 数据处理

计算每个菌落直径的平均值和药剂对菌丝生长的抑制率。使用SPSS 22.0 软件进行分析，将药剂质量浓度转化为以10 为底的对数值作横坐标，各处理质量浓度的生长抑制率转化成概率值作纵坐标，求出各药剂的毒力回归方程、半最大效应浓度（EC50值）和相关系数[13]，根据EC50值评价杀菌剂的毒力大小。

菌丝生长抑制率(%)=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼直径)×100

2 结果与分析

2.1 病原菌形态和发病症状

经组织分离纯化的菌株高度一致，选取代表菌株LA-02 在PDA 培养基上25 ℃培养6 d 后，菌落呈白色轮纹絮状（图1A，B），15 d 后菌落上出现含分生孢子的黑色黏液（图1C）。分生孢子呈梭形、椭圆形或近圆柱形，直或稍弯曲，大小为（21 ～29）μm × （7 ～ 9）μm，孢身4 个隔膜；顶端细胞透明，中间3 个细胞着色，圆锥或圆柱形，细胞壁薄且光滑，具有2 ～ 3 根顶端附属丝，一根基部附属丝（图1D）。菌株LA-02 形态学特征与新拟盘多毛孢属Neopestalotiopsissp. 真菌较为一致[14]。

图1 曼地亚红豆杉枝枯病病原菌落特点Fig. 1 Pathogen colony morphology of T. × media branch blight

接种LA-02 后的发病植株病斑部位再次组织分离获得菌株的菌落特征、分生孢子形态等均与LA-02 一致；感病部位呈淡褐色，逐渐凹陷、溢缩，呈现明显凹斑，皮层干枯（图2A，B）；对照组伤口无任何感病症状（图2C）。因此，分离菌株LA-02确定为曼地亚红豆杉枝枯病的病原菌，符合科赫法则。

图2 曼地亚红豆杉枝枯病发病症状Fig. 2 Symptom of T. × media branch blight

2.2 系统发育树

菌株LA-02 与新拟盘多毛孢属棒状新拟盘多毛孢菌N.clavispora聚类在一个小的分支上（图3）。LA-02 的ITS 序列（ON394607）与NCBI 中ITS 序列（MG729676.1）相似度达100%，β-tubulin序列（OQ 790164）与NCBI 中β-tubulin序列（OP654877.1）相似度达100%，tef1序列（OQ790165）与NCBI 中tef1序列（MT745889.1）相似度达98.83%。结合系统发育分析与形态学鉴定特征，将曼地亚红豆杉枝枯病病原菌LA-02 确定为棒状新拟盘多毛孢N.clavispora。

图3 联合rDNA-ITS，β-tubulin 和tef1 基因序列构建的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of LA-02 constructed by combining rDNA-ITS, β-tubulin and tef1 gene sequences

2.3 杀菌剂的毒力

6 种杀菌剂均对菌株LA-02 的菌丝生长有不同程度的抑制作用（表1）。50%多菌灵WP 和250 g/L吡唑醚菌酯EC 对菌丝的抑制效果较好，EC50分别为0.065，0.548 mg/L，且无显著差异。

表1 药剂对曼地亚红豆杉枝枯病病原菌的室内毒力Tab. 1 Laboratory toxicity of different fungicides to pathogen of T. × media branch blight

3 讨论

新拟盘多毛孢属真菌属于子囊菌门Ascomycota，其寄主专化性不高，可侵染多种植物，引起枝枯、叶枯、叶斑等不同症状，是重要的植物病原菌[15-16]。由于形态学指标的界限不明显，拟盘多毛孢属真菌的分类一直存在争议，曾经过多次修正[17]。2014 年，Maharachchikumbura 等以LSU 构建系统进化树为依据，并结合形态学特征，将拟盘多毛孢属Pestalotiopsis进一步分为新拟盘多毛孢属Neopestalotiopsis、拟盘多毛孢属Pestalotiopsis以及假拟盘多毛孢属Pseudopestalotiopsis[18]。

Jeewon 等[19-20]指出，新拟盘多毛孢属真菌的形态学和分子生物学特征具有对应关系，将两者相结合进行鉴定，结果更为准确，尤其是多基因序列联合分析能够更为科学地对新拟盘多毛孢属真菌进行鉴定，联合ITS、tef1和β-tubulin进行串联系统发育分析能够较好地区分拟盘多毛孢的模式种，是目前较为准确的鉴定方式[21-22]。有学者基于形态学观察，并通过联合rDNA-ITS、β-tubulin、tef1进行多基因分析，将引起广东地区女贞叶斑病病原确定为棒状新拟盘多毛孢N.clavispora[23]；也有学者联合rDNA-ITS、核糖体大亚基（LSU）将引起福建地区南方红豆杉叶斑病的病原确定为N.clavispora[24]。本研究分离得到曼地亚红豆杉枝枯病病原代表菌株LA-02，经形态学、致病性测定和rDNA-ITS、βtubulin、tef1基因联合分析，鉴定其为棒状新拟盘多毛孢N.clavispora。

通过对供试菌株进行室内毒力测定可以看出，多种供试药剂对LA-02 菌丝生长具有很好的抑制效果，其中50%多菌灵WP 和250 g/L 吡唑醚菌酯EC 对菌丝生长有较强的抑制作用。多菌灵为高效低毒内吸性杀菌剂，对许多植物真菌病害都有良好防效，且对土壤微生物影响小[25]。李青杰 等[26-27]研究发现吡唑醚菌酯对N.clavispora抑制效果最好，具有较高的抑菌活性，可深入进行田间防治试验。温浩 等[28]发现咪鲜胺、戊唑醇等药剂对新拟盘多毛孢病菌均有一定抑制作用。因此，咪鲜胺、戊唑醇等可作为备选药剂以应对N.clavispora的抗性发展。

供试杀菌剂的EC50仅作为室内毒力参考，不能直接应用于林间，实际应用中会受到多种环境因素的影响，因此本研究的结果还需进行林间防治试验加以验证，明确其发病规律和发生原因，综合分析诱发因素，以更准确地指导曼地亚红豆杉枝枯病的科学防治。