棉酚对食管癌细胞系SEG-1细胞裸鼠模型体内作用的研究

陈 萍 刘 芳 艾惠如 张 利

青岛大学附属泰安市中心医院1. 消化内科； 2. 门诊部； 3. 急诊科， 山东 泰安 271000

近几年来，恶性肿瘤的发病率呈逐年升高趋势，根据GLOBOCAN 2020 的估计，全球诊断出近2 亿例新癌症病例，而这些病例中近23.7%发生在中国［1］。我国是世界上最大的发展中国家，有着巨大的癌症负担。过去35年中，食管癌始终为我国常见的恶性肿瘤之一，其具有隐匿性、进展快、预后差及存在地区差异等特点，其发病率和死亡率一直居高不下［2-3］。因此，积极预防和治疗食管癌对改善患者健康水平具有重要意义。近10来年，虽进行了大量的研究和实践，但食管癌患者的生存率仍未有明显的改善。因此越来越多的学者开始重视食管癌的发生、发展机制的研究，并据此寻找更为有效的靶点药物，以提高食管癌患者的生存率。食管癌患者通常免疫功能低下，加之手术创伤等，致使术后患者早期一般不能耐受毒副作用大的化疗药物，从而使得体内的癌细胞迅速生长、扩散。由此可见，食管癌术后患者应使用毒副作用轻且有强抗肿瘤作用的药物。目前，大多数研究集中于从自然界中寻找新的化学药物。植物化学物为植物中天然存在的、含量较少的一类具有抗突变、抗癌或其它生理活性的化学物质。抑制增殖和诱导凋亡是化疗药物的主要作用机理，肿瘤细胞的耐药性也是导致化疗失败的最主要原因，因此寻找具有强抗肿瘤活性，且能提高肿瘤对化疗药物敏感性的植物化学物是近期研究的热点。

棉酚是由棉籽提取的化合物。自20世纪60年代开始研究者发现棉酚具有抗肿瘤作用。研究表明，棉酚可抑制肺癌、白血病、结肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、头颈部肿瘤、肾上腺皮质肿瘤等肿瘤细胞系细胞的增殖及诱导细胞凋亡，另外可增加耐药肿瘤细胞对化疗的敏感性［4］。有许多研究表明，棉酚具有较好的耐受性，对部分常规化疗失败的患者可提高疗效，但其机制尚未明确。本团队既往研究已证实，单醛棉酚与醋酸棉酚均对食管癌细胞系SEG-1 具有抗增殖、阻止细胞周期的作用［5］。本研究旨在探讨棉酚在体内的抗癌作用，寻找食管癌防治的新思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

人食管癌细胞系SEG-1，由郑州大学消化疾病研究所提供。健康SPF 级BALb/c 雌性裸鼠30 只，济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，体质量13 ～18 g。醋酸棉酚、单醛棉酚均由上海谱振生物科技有限公司提供。RPMI1640 培养基，美国Invitrogen公司。胎牛血清，天津懿阳生物制品有限公司。L-谷氨酰胺，北京天根生化科技有限公司。青霉素、链霉素，美国Amresco 公司。台盼蓝，美国Sigma 公司。二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO），北京博大泰克公司。75%酒精，山东瑞泰奇洗涤消毒科技有限公司。NaCl， KCl，分析纯，南京化学试剂一厂。磷酸氢二钾（K2HPO4），磷酸二氢钠（NaH2PO4），成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 主要溶液制备 PBS 缓冲液：取KCl 0.2 g、NaCl 8.0 g、Na2PO43.49 g、K2HPO40.24 g，加入去离子水，搅拌至完全溶解，调节pH值 = 7.4后，定容至1 L，高压灭菌，4 ℃保存备用；棉酚：在超净工作台上以无菌级DMSO 配成50 μmol/L 储存液，-20 ℃冷冻保存，每周配制1 次。配好后在含血清的固体培养基中进行细菌培养72 h，无菌生长方可使用；RPMIl640培养基配制：称取10.4 g RPMIl640粉末，加入3.7 g NaHCO3， 2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 链霉素，调整pH 到7.2，加蒸馏水定容至l L，0.22 μm 过滤除菌，加入经灭活处理（56 ℃，30 min）的10%的胎牛血清，4 ℃保存；棉酚配制：每次动物实验前新鲜配制所有浓度的棉酚，以DMSO溶解后再溶于PBS中，DMSO终浓度为10%。

1.2.2 细胞培养 将食管癌细胞系SEG-1 放在含2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 U/mL链霉素、10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的RPMI l640 培养基中，放在5%CO2、37 ℃、饱和湿度下培养。0.25%的胰蛋白酶消化细胞传代，每2 ～ 3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.3 食管癌细胞系SEG-1 细胞动物模型建立取对数生长期的细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，收集消化液离心后除去上清液，加入培养液制成细胞浓度约为1 × 107/mL 悬液待种，用75%酒精消毒裸鼠局部皮肤后，用注射器抽取0.2 mL细胞悬液注射到每只裸鼠的左前肢腋窝皮下。裸鼠左前肢腋窝长出肿块后，将肿块解剖制成细胞悬液后进行Wright-Giemsa染色观察肿瘤细胞的形态学。

1.2.4 裸鼠分组方法、给药方法及观察指标 裸鼠接种癌细胞72 h后，在小鼠腹腔内注射200 μL的醋酸棉酚或单醛棉酚溶液。将30只裸鼠分6组，分别为醋酸棉酚40 mg/kg组、醋酸棉酚60 mg/kg组、单醛棉酚40 mg/kg组、单醛棉酚60 mg/kg组、空白对照组、阴性对照组，各组5 只；醋酸棉酚40 mg/kg 组在接种后第4 天和第6 天注射醋酸棉酚溶液，每天注射剂量为20 mg/kg；醋酸棉酚60 mg/kg 组在接种后4、5、6 天注射醋酸棉酚溶液，每天注射剂量为20 mg/kg；单醛棉酚40 mg/kg组在接种后第4天和第6 天注射单醛棉酚溶液，每天注射剂量为20 mg/kg；单醛棉酚60 mg/kg组在接种后第4、5、6天注射单醛棉酚溶液，每天注射剂量为20 mg/kg。空白对照组不接种肿瘤及不给药、阴性对照组接种SEG-1细胞，腹腔注射含10%DMSO的PBS。每日观察裸鼠的活动、皮肤变化，记录给药前及给药后每天体质量、肿瘤大小，裸鼠死后则记录其生存时间，死后12 h 内取肝、脾测肝、脾质量。

肿瘤生长变化：记录给药当天即0天，每隔1天用游标卡尺测量裸鼠肿瘤最大的长径、宽径、厚径1次，三径相互垂直，记录体积变化。瘤体积计算方法：肿瘤体积（mm3） = 长径 × 宽径 × 厚径 × π/6。肿瘤生长抑制率：［1-（阴性对照组肿瘤的平均体积在1 g左右时给药各组的肿瘤平均质量/阴性对照组肿瘤的平均质量）］ × 100%。肿瘤生长延迟：给药各组肿瘤重量达到0.7 g时的天数和阴性对照组达到相同质量的天数之差。

1.3 统计学处理

选用SPSS 21.0 统计学软件进行数据处理，符合正态分布数据用计量资料（x¯ ±s）描述，经方差齐性检验后，多组间比较用LSD 检验，两组间比较采用独立样本t检验。检验水准α= 0.05。

2 结 果

2.1 食管癌SEG-1细胞裸鼠模型的建立

裸鼠在接种前生活状态始终正常、食欲旺盛、行动自如。皮下接种1 × 107个SEG-1细胞后第1天即出现精神萎靡、饮食不振、体毛耸立等症状，继而行动迟缓直至死亡。裸鼠在接种细胞第4天时皮下出现肉眼可见的明显肿块，肿块逐渐增大，裸鼠存活时间为（13.0 ± 1.0）d。死亡后解剖发现肿瘤灶与周围组织粘连，部分裸鼠腹腔有腹水，肝脾肿大。肿块解剖后制作成细胞悬液，染色后于显微镜下观察肿瘤细胞形态结构与SEG-1细胞一致。

2.2 病理学检查

本研究选取醋酸棉酚40 mg/kg 组代表给药组肿瘤与阴性对照组裸鼠的肿瘤标本进行病理对照。给药组肿瘤大小及浸润范围均小于阴性对照组，肿瘤分化稍好于阴性对照组，肿瘤血管形成较阴性对照组差。

给药组：与阴性对照组的肿瘤组织比较，肿瘤细胞分化较好，肿瘤间质组织较丰富，细胞形态较一致，细胞较大，胞浆丰富，病理性核分裂少。肿瘤血管形成差，可见部分细胞缺血性坏死。肿瘤浸润范围较小，尚未超过基底层（图1）。

图1 给药组裸鼠皮下肿瘤的病理表现（HE染色， × 400）

2.3 棉酚在裸鼠体内的抗肿瘤活性

各给药组裸鼠皮下肿块均出现不同程度的缩小、肿块生长速度减慢（图2A）。肿瘤生长抑制率：醋酸棉酚40 mg/kg组、醋酸棉酚60 mg/kg组、单醛棉酚40 mg/kg组、单醛棉酚60 mg/kg组分别为14.3%、31.2%、33.7%、32.9%，醋酸棉酚40 mg/kg 组的生长抑制率明显低于醋酸棉酚60 mg/kg 组、单醛棉酚40 mg/kg组、单醛棉酚60 mg/kg组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），醋酸棉酚40 mg/kg 组肿瘤生长延迟天数比醋酸棉酚60 mg/kg组、单醛棉酚40 mg/kg组、单醛棉酚60 mg/kg 组少1d，见表1。各组裸鼠接种后肿瘤质量、体积变化趋势见图2A和2B。

表1 各给药组肿瘤生长抑制率和肿瘤生长延迟情况比较

图2 不同剂量醋酸棉酚和单醛棉酚对接种SEG-1细胞的裸鼠肿瘤的影响

2.4 棉酚对接种肿瘤裸鼠肝、脾脏的影响

2.4.1 棉酚对接种肿瘤裸鼠肝的影响 在接种肿瘤后第10天、死亡时解剖裸鼠发现，未接受棉酚干预的阴性对照组裸鼠肝脏较正常裸鼠肝脏明显增重，说明SEG-1肿瘤细胞已经发生肝转移；给予40 mg/kg醋酸棉酚干预的接种裸鼠肝脏质量明显低于阴性对照组；给予60 mg/kg 醋酸棉酚干预的裸鼠由于存活时间较短，肝脏质量未列入统计。给予40 mg/kg 或60 mg/kg单醛棉酚干预的裸鼠肝脏较对照组并没有减轻，说明醋酸棉酚除了对肿瘤细胞产生毒性作用外，还对肝脏正常细胞产生毒性作用，而单醛棉酚不同剂量对裸鼠的肝脏并无明显影响，见表2和图3。

表2 不同浓度棉酚对接种裸鼠肝脏重量的影响

图3 不同浓度两种棉酚对接种肿瘤裸鼠生存期的影响（与对照组相比，*P ＜ 0.05）

2.4.2 棉酚对接种肿瘤裸鼠脾的影响 在接种肿瘤后第10 天、死亡时解剖裸鼠发现，未接受棉酚干预的阴性对照组裸鼠脾脏较正常裸鼠脾脏明显增重，说明SEG-1 肿瘤细胞已经发生脾转移。给予40 mg/kg醋酸棉酚干预的接种裸鼠脾脏质量明显低于阴性对照组；给予60 mg/kg 醋酸棉酚干预的裸鼠由于存活时间较短，脾脏质量未列入统计。而给予40 mg/kg或60 mg/kg单醛棉酚干预的裸鼠脾脏肿瘤较阴性对照组虽有降低，但降低程度较小，说明醋酸棉酚除了对肿瘤细胞产生毒性作用外，还对脾脏正常细胞产生毒性作用，而单醛棉酚不同剂量对裸鼠的脾脏影响较小，见表3。

表3 不同浓度棉酚对接种裸鼠脾脏质量的影响

2.4.3 棉酚对接种肿瘤裸鼠生存期的影响 醋酸棉酚40 mg/kg 组裸鼠生存时间为8 ～ 13 d，平均（8.9 ±1.0）d；醋酸棉酚60 mg/kg组裸鼠生存时间为6 ～ 11 d，平均（8.2 ± 0.9）d；单醛棉酚40 mg/kg 组裸鼠生存时间为10 ～ 16 d，平均（12.9 ± 0.6）d；单醛棉酚60 mg/kg组裸鼠生存时间为10 ～ 15 d，平均（12.3 ± 0.8）d；阴性对照组裸鼠生存时间为10 ～ 18 d，平均（13.1 ±1.1）d。醋酸棉酚40 mg/kg组、醋酸棉酚60 mg/kg组裸鼠生存时间明显短于阴性对照组；单醛棉酚40 mg/kg 组、单醛棉酚60 mg/kg 组裸鼠生存时间与阴性对照组比较，差异无统计学意义，见图4。

图4 各组的裸鼠接种肿瘤后体重随时间的变化

2.4.4 棉酚对接种裸鼠体质量的影响 阴性对照组裸鼠接种SEG-1细胞后13 d后体质量显著超过未接种SEG-1 细胞的裸鼠。醋酸棉酚40 mg/kg 组、醋酸棉酚60 mg/kg组裸鼠经腹腔注射醋酸棉酚后第1天开始出现活动减少，逐渐消瘦；醋酸棉酚60 mg/kg组裸鼠体质量在用药第5天开始显著低于阴性对照组，醋酸棉酚40 mg/kg 组裸鼠体质量在用药第6 天开始显著低于阴性对照组。单醛棉酚40 mg/kg 组、单醛棉酚60 mg/kg 组裸鼠经腹腔注射醋酸棉酚后体质量变化与阴性对照组基本一致（见图4）。

3 讨 论

食管癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，我国发病和死亡人数分别占全球的53.7%和55.3%［6］。据2019 年中国肿瘤登记年报结果显示，我国2015食管癌发病24.6 万，居恶性肿瘤第6 位；死亡18.8万，居恶性肿瘤死亡第4位［7-8］。食管癌好发于男性人群，其在我国男性患者死亡率仅次于第1 位的胃癌，而在女性患者中仅次于宫颈癌居第3位，因此该病已成为威胁人们生命健康的重要疾病。手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、内镜治疗和中医药治疗等方法是食管癌目前常用的治疗方法。然而，即便近年来已不断改善，这些方法的疗效仍不完全令人满意，食管癌仍为预后较差的恶性肿瘤之一，我国食管癌患者总体5年生存率仅为29.7%［9］。因此选择新的抗食管癌药物，探索新的靶向治疗，是目前食管癌治疗的热点问题。

化疗是肿瘤治疗领域中重要的治疗手段，然而，传统的化疗药物往往毒副作用较大，治疗期间，肿瘤患者的正常器官组织也会受到不同程度的损害，故寻找无毒副作用或较轻毒副作用的药物已成为肿瘤治疗的新热点。并且我国食管癌早期发现率低，确诊时I期患者仅占17%［2］，化疗在食管癌的治疗中起着重要的作用。近年来，食管癌的化学防治多集中于丁酸甘油脂、维生素类、姜黄素、棉酚等药物，其中棉酚具有抑制多种恶性肿瘤生长的作用，其部分衍生物由于毒副作用轻微而引起广大学者的重视。

目前，有关棉酚的抗肿瘤作用主要通过体外实验得以证实，而本实验则将其作为新药物进行体内研究加以证实该药的抗肿瘤特性。研究发现，很多体外实验研究证实的Bcl-2小分子抑制剂具有良好的抗肿瘤特性，但应用于临床试验时却不能达到预期的疗效，其原因是这些药物在体外实验所具有的抗肿瘤作用或细胞毒性作用在体内实验时无法发挥。为此，本实验在SEG-1 裸鼠模型中应用棉酚干预，以了解棉酚是否能在裸鼠体内发挥抗肿瘤的特性。实验结果显示，棉酚的2 种衍生物醋酸棉酚和单醛棉酚在食管癌细胞系SEG-1细胞裸鼠模型体内产生一定的抗肿瘤作用。不同浓度的醋酸棉酚、单醛棉酚均可减小肿块，其中40 mg/kg 醋酸棉酚的肿瘤抑制率最低，为14.3%，肿瘤生长延迟2 天，而60 mg/kg 醋酸棉酚为31.2%，40 mg/kg、60 mg/kg 单醛棉酚的肿瘤抑制率分别为33.7%、32.9%，肿瘤生长延迟均为3 d。另外，实验结果显示，阴性对照组的肝脾均较正常增大，提示肿瘤已发生了肝脾转移；给予醋酸棉酚治疗后，裸鼠的肝脾均出现缩小，提示醋酸棉酚可有效地缩小肿大的肝脾，对转移性肿瘤具有抑制作用。然而醋酸棉酚同时缩短了裸鼠的生存时间，表明它虽具有抗肿瘤的特性，但同样对正常组织细胞产生毒性作用。单醛棉酚则不同，其对肿瘤组织具有抗增殖作用，同时对肝脾正常细胞毒性作用较小，从而延长了裸鼠的生存时间。

传统的实验证实，棉酚的治疗范围较窄。它在临床应用中易出现以下毒副作用：①生殖毒性，棉酚具有杀精作用，早期作为男性避孕药而应用于临床，然而作为抗肿瘤药物时，这种杀精作用则成为不良反应。②肝脏毒性，应用棉酚处理的小鼠肝脏病理可见充血性坏死，其机制可能与电子传递、氧化应激、自由基密切相关［10］。本实验结果也证实了醋酸棉酚对肝脏具有一定的毒性作用。③心脏毒性，棉酚可引起实验小鼠呼吸困难、颈静脉怒张、心律失常等表现，棉酚具有阻止氧化血红蛋白释放氧的作用。④低钾血症，在棉酚的早期应用研究中，研究者们发现，低钾血症是棉酚的一个较严重的副作用，但近期研究表明，低钾血症并非完全是棉酚引起，而与地区差异、饮食习惯、营养不良等相关。

棉酚分子结构中存在2 个活性醛基，这是产生毒性的主要活性结构，通过阻断醛基的作用是降低棉酚的毒性有效方法［11］。药理研究表明，若同时阻断棉酚分子结构中的2 个活性醛基，棉酚就会失去抗肿瘤活性，若保留1 个醛基则可使棉酚具有抗肿瘤作用的同时，毒性也明显降低［12］。鉴于此，本实验采用无活性醛基的醋酸棉酚和有1个活性醛基的的单醛棉酚做对照。本动物实验发现，醋酸棉酚具有较大的毒性，而同剂量的单醛棉酚则无明显毒副作用，故推测，单醛棉酚较醋酸棉酚更适用于临床。本实验观察到裸鼠的生存期并未得到有效延长，肿瘤在短期抑制后即会迅速增长，提示棉酚在体内的作用尚待进一步提高。研究表明，血清中的蛋白与棉酚结合，从而降低棉酚的活性，使其抗肿瘤作用降低［13］。因此，寻找阻断棉酚与体内血清蛋白结合的方法也是当前有关棉酚研究的一个热点。潘奇等［13］研究表明，棉酚联合其他化疗药物治疗可增强化疗的效果，如联合CHOP 和棉酚治疗淋巴瘤能获得比单一CHOP 治疗更好的效果，因此化疗药物联合棉酚对食管癌的治疗也是下一步研究的方向。

综上所述，棉酚可抑制食管癌裸鼠模型的肿瘤生长，醋酸棉酚具有明显的毒性作用，而单醛棉酚有较高的安全性，这为未来将棉酚应用于食管癌的临床治疗提供了实验依据。