循环肿瘤细胞在前列腺癌中的应用

韩明帅 武英欣 金讯波，2

1. 山东第一医科大学研究生部，山东 济南 250024；2. 山东第一医科大学附属省立医院泌尿外科，山东 济南 250021

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是全球癌症新发的第3大肿瘤，2020年全球有新发病例1 414 259人，新增死亡病例375 304 人［1］。在男性中，PCa 是112个国家最常诊断出的癌症，在死亡率方面，位于前三位的是肺癌、 PCa和肝癌。

前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）筛查在各级医院的广泛应用，使得部分患者在诊断时肿瘤还较为局限，部分患者可以选择根治性手术或根治性放射治疗，得到令人满意的临床预后，其五年生存率接近100%，但仍有一部分患者肿瘤会继续进展，甚至出现远处转移，而转移性病例的五年生存率为29.8%［2］。即使在初期经过雄激素剥夺疗法（androgen deprivation therapy， ADT）治疗得到了很好地控制，随着时间的延长，很大一部分患者还是会进展到转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）阶段，这一阶段是PCa 患者死亡的最主要阶段。前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）虽然是唯一批准的指导PCa 治疗决策的生物标志物，由于敏感性和特异性不足［3］，且无法区分病理阶段［4］，因此迫切地需要寻找可靠的替代标志物，指导PCa的诊疗。

液体活检由于其具有简单微创等特点，近年来受到了广大临床医生及研究者的关注。在PCa这个领域，最具代表的就是循环肿瘤细胞（circulating tumor cell， CTC）检测，CTC 是来源于肿瘤原发灶或转移灶脱落而进入全身循环系统的肿瘤细胞，与原发肿瘤具有一致性，具有一定原发肿瘤的特征。近年来众多研究者试图通过研究CTC的特性，探究原发肿瘤的特征，使用CTC 等生物标志物指导PCa 的个性化治疗，为患者进行更加精准的治疗提供了可能性［5］。众所周知，PCa 是一种高度异质性的疾病［6］，一些患者肿瘤表现为惰性，另一些则表现为高度侵袭性，在这种情况下确定预后转归至关重要，需要更全面的风险分层和预后标志物，改善局限性PCa患者的管理，确定进展风险高的病例，也要确定对特定疗法有益的预测生物标志物，以帮助医生在适当的时间为患者选择最合适的治疗方案［3，6］。CTC 代表扩散的肿瘤细胞，并在监测转移、评估治疗效果和促进早期检测、治疗耐药性方面为个体患者的治疗提供重要的临床信息［7］。

1 CTC检测平台

CTC 是通过基于血液的液体活检获得的，由于侵入性最小，因此可以实时监测癌症［8］。近年来，已经涌现出众多的CTC检测的技术平台，主要是依据CTC 的免疫亲和力及物理特性（肿瘤细胞的大小、密度）来进行CTC检测。依据CTC的物理特性进行CTC 检测的平台，因其可靠性和廉价性使其成为一种广泛使用的CTC分离方法，但其消除白细胞污染的能力有限，导致纯度低于1%。因此，研究人员通常使用其系统作为初始富集步骤，然后再使用其他策略进行额外处理［9］。

基于免疫亲和力进行检测的平台种类众多，应用最广泛，其中最具代表性的是CellSearch 系统，CellSearch 系统是唯一获得美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration， FDA）授权的CTC 检测系统，也是在该领域应用最广泛的系统。研究表明，使用CellSearch 系统捕获的CTC 计数增高与患者预后不良显著相关［10］。CTC 检测可以基于物理和生物学特性来实现。目前，已经开发了数个平台来检测CTC，每种平台都利用CTC 的特征进行敏感选择和捕获，重点是如何在保持微创的同时快速、高灵敏度、高特异性地检测CTC［11］。该系统应用上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）包被的铁磁流体纳米颗粒来选择EpCAM阳性细胞，然后通过CK8、CK18、CK19 免疫荧光染色（immunofluorescence， IF）阳性和CD45 阴性来确认捕获的细胞为CTC，但该平台捕获的CTC 纯度低，灵敏度为27% ～ 70%，特异度89% ～ 93%。目前该平台已广泛用于监测转移性乳腺癌、结直肠癌、肺癌或PCa［12，13］。AdnaTest 系统是基于CellSearch系统改良的平台，应用涂有抗体混合物（EpCAM、MUC-1 等）的磁珠，然后通过多重反转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）基因组分析捕获CTC［14-15］，是从肿瘤中分离出的CTC 中检测癌症相关基因的代表性方法，AdnaTest 对基因检测比CellSearch 系统更敏感［16］。CellCollector 系统是一种特殊类型磁性纳米粒子平台，该平台是一种侵入性检测方法，在患者静脉内放置EpCAM涂层线用于收集CTC，该平台可检测处理大量的血液，可提高CTC检出率［17］。近年来涌现了很多微流控平台，不仅能够实现CTC检测、分离，更重要的是能够实现细胞培养［18］。

Ephesia系统属于最新一代捕获平台，将免疫磁珠与微流体的优势相结合，同时也结合CTC的免疫亲和力及物理特性（肿瘤细胞的大小、密度）来进行CTC 检测，解决了单一平台的缺点［19］。该平台具有高特异度（100%）、高灵敏度（99.1%）、高活性（被捕获细胞的活力保持在98%）的特点，应用前景巨大［20］。相信随着技术的进步，未来会出现更加优越的平台，重点也将从量化转向分子分析［21］。

2 循环肿瘤细胞在PCa中的应用

2.1 CTC在早期局限性PCa中的应用

PSA虽然是唯一批准指导PCa治疗决策的生物标志物，但通常不代表当前肿瘤状态［4］，需要寻找其他可靠的替代标志物，指导PCa的诊疗，许多研究者在此方向付出努力。Meyer 等［22］研究共纳入152 例局限性PCa 患者，仅在17 例（11%）患者中检测到CTC，并发现CTC的检测与PSA、生化复发没有显著相关性。Mandel 等［23］研究纳入33 例局限性PCa 患者，共16例（48.5%）患者在PCa 根治性切除术前检测到存在CTC，也未发现其与临床参数之间存在显著相关性。总之，在早期局限性PCa阶段，多数研究者认为，CTC 阳性与否与临床病理学风险参数、PSA、生化复发等没有显著相关性［22，24-25］，目前尚不清楚是否因CTC 的阳性检出率（11% ～ 48.5%）较低［22-26］，或是因早期患者体内CTC 较少以至于不适合CTC检测，还需要更多研究证明。

随着检测平台的进步，情况正在发生变化。Theil 等［27］研究纳入16 例局限性PCa 患者，比较了CellSearch 和CellCollector 2 种CTC 检测平台。CellCollector 和CellSearch 的阳性率分别为43.75%和12.5%。CellCollector系统的CTC检出率较高，未来可能为非转移性PCa患者的诊断及治疗提供较大的作用。Kuske 等［28］又创新性地将CellSearch 与CellCollector 和EPISPOT 测定（基于白细胞消耗对CTC 富集）进行比较，研究表明，只有EPISPOT 检测到的CTC 与临床参数［如PSA 值（P＜ 0.001）］和临床肿瘤分期（P= 0.04）显著相关。但是相关研究较少，纳入样本少，还有待进一步深入研究。相信随着技术的进步，会涌现出更加先进的检测平台，可以使得CTC 检测在早期PCa 阶段的研究更加深入，将可能给这一阶段的患者提供更加精准的疾病监测及治疗指导。

2.2 CTC在mCRPC中的应用

对于转移性PCa 的治疗，初期阶段主要以ADT治疗为主，但最终患者都不可避免地进入mCRPC阶段，该阶段是患者死亡的最主要原因。虽然CTC在早期PCa 中的意义较小，但是对于mCRPC 来说，是有前途的生物标志物，已经在转移性乳腺癌、PCa和结直肠癌等多种疾病中显示出预后相关性［29-30］，CTC 计数为 ≥ 5 个/7.5mL 与较短的总生存期（overall survival， OS）显著相关［25-26，31］。Stott 等［26］研究显示，CTC 阳性率为64%［中位数为32 CTCs/mL；范围为14 ～ ＞ 5 000；平均值为（116 ± 35）］。6例先前未治疗的转移性PCa患者在开始ADT治疗之后，CTC 计数明显下降，与治疗引起的PSA 浓度下降一致。在随访期间，通过单个细胞的PSA染色鉴定的CTC 数量与血清PSA 蛋白浓度高度一致，因此该研究认为，CTC 数量和血清PSA 浓度这2 种生物标志物都反映了肿瘤细胞对有效治疗的反应。该研究还观察到，术后CTC 降低存在快速和缓慢2 种模式的CTC 半衰期，认为缓慢降低的患者体内可能在PCa 病程早期就已经存在微转移灶，但大多数前列腺外肿瘤沉积物的长期生存能力有限，所以CTC最终在切除原发肿瘤后缓慢消退。如果这一假设得到证实，还将支持在转移性病变建立前将CTC监测作为侵袭性标志物应用。

大多数研究者都是使用EpCAM 抗体筛选CTC细胞，但不是所有CTC 都高表达EpCAM，有研究试图将低表达EpCAM CTC 也纳入研究，以提高CTC的检出率。Wit 等［32］研究纳入了108 例mCRPC 患者 ，共 91 例（70%）患 者 EpCAM高 CTC +EpCAM低CTC ≥ 5个细胞，EpCAM高 CTC的阳性率约为53%（56/108）。研究发现，EpCAM高CTC ≥ 5的去势抵抗性PCa患者与EpCAM高CTC ＜ 5的患者相比，OS 较短（P= 0.001），然而EpCAM低CTC 的存在与OS无关。Kozminsky等［31］研究纳入41例转移性PCa患者，其CTC 阳性率为100%，CTC 数量范围为3 ～166（中位数：20） CTC/mL。CTC 的阳性检出率不断提高显示出了巨大的应用潜力。CTC 提供了一个机会，可以通过液体活检研究PCa 的潜在生物学和疾病轨迹，是PCa最具前景的无创检测技术之一。

2.3 CTC 衍生的雄激素受体剪接变体7（androgen receptor splice variant 7， AR-V7）检测作为晚期PCa的预后和预测生物标志物。

随着研究的深入，CTC 在风险评估、治疗功效监测、耐药性监测、转移预测、预后预测等多个方面显示出巨大的潜力［28，33-35］，研究的重点也转向CTC表型特征方向，在所有PCa 表型特征中最受关注的是雄激素受体（androgen receptor， AR）［36］，预后和预测标志物最重要的例子之一是CTC 中AR-V7 的检测［37］，研究证明CTC 中AR-V7 阳性与预后不良有关［38］。

Cattrini 等［39］研究纳入39 例 mCRPC 患者，其中24 例接受了mCRPC 一线治疗（A 组），15 例接受了至少两线治疗（B 组）。在B 组中发现的CTC+患者比例高于A 组（73.3%vs.41.7%；P= 0.054）。2/24（8.3%）例患者在A 组中被检测到了AR-V7 阳性，5/15（33.3%）例患者在B 组中被检测到了ARV7 阳性（P= 0.08）。与A 组相比，CTC 和AR-V7 在B 组中富集。CTC+患者的中位OS 为15.0 个月，而CTC-患者未达到（HR：7.40，95%CI：1.53 ～ 35.82；P= 0.01），AR-V7+患者的OS 估计值为4.7 个月，而AR-V7-患者未达到（HR：20.31，95%CI：5.54 ～74.49；P＜ 0.001）。证实了CTC 及AR-V7 的预后预测作用，AR-V7似乎是对ARSi治疗反应预测的最有希望的生物标志物。Antonarakis 等［40］的研究招募了更多的患者，202例男性中有53例（26.2%） 为CTC-，113 例（56.0%）为CTC+/AR-V7-，36 例（17.8%）为CTC+/AR-V7+。该研究划分3 个独立的预后类别，在PSA 反应、PSA-PFS、无进展的生存期(progression-free-survival， PFS）和OS 方面，CTC-患者有最佳结果，CTC+/AR-V7-患者具有中间结果，而CTC+/AR-V7+患者显示出最差的结果。研究进一步证实了基于CTC 的AR-V7 mRNA 检测在预测预后方面的重要性。Nimir 等［41］对来源的CTC 样本、ctRNA 样本和外泌体中的AR-V7 和AR-FL 检测进行比较，数据显示来源于CTC样本的生物标志物检测是最可靠的。Re 等［42］研究纳入73 例 CRPC 患者所有患者均检测到全长雄激素受体(AR-FL)，而基线时 22%的患者为AR-V7+。AR-V7+与AR-V7-患者相比，AR-FL 表达显著升高。按AR-FL 表达的三分位数对患者进行分层， PFS 分别为22 个月、18 个月和4 个月。发现对AR 导向治疗的抵抗与AR-V7 的存在有关，AR-FL 表达可能有助于更好地改善患者对AR 导向治疗的反应和生存。这2 种生物标志物都可用于最佳治疗策略的选择。这显示了CTC及ARV7检测在mCRPC患者预后预测及治疗选择等方面的巨大作用。

Scher等［43］研究显示，接受紫杉烷类药物治疗的AR-V7+患者的总生存期优于接受ARS 抑制剂治疗的患者（中位总生存期，14.3vs.7.3 个月，P=0.25）。接受ARS 抑制剂治疗的AR-V7-患者的OS优于接受紫杉醇药物治疗的患者（中位OS，19.8个月vs.12.8个月，P= 0.05）。这为需要在ARS抑制剂或紫杉醇之间选择来改变治疗方式的mCRPC 患者提供重要的依据。有效延长了患者的生存时间，为临床工作提供了指导。

3 总结与展望

CTC 与早期局限性PCa 和局部进展性高危PCa的相关性不强，还有待进一步研究。在早期局限性PCa阶段，大多数研究者认为，CTC计数与临床变量没有显著相关性。但随着CTC 检测由简单的计数转向表型特征等更加深入研究方向以及检测平台的进步，这一情况可能会发生变化。

在去势抵抗性PCa 阶段，将CTC 计数与基因检测（AR、AR-FL、AR-V7等）、表型分析、核酸测序等相结合，可以为患者提供无创的连续监测，为给予患者个性化、精确的治疗提供了可靠依据。在几项单中心研究中证明，在CTC中检测到AR-V7与预后不良有关。接受紫杉烷治疗的 AR-V7 阳性CTC 的患者死亡风险低于使用ARS 抑制剂的患者。随着更多的研究发现，对于指导PCa 的诊断及治疗有着极其重要的意义。

未来，关于CTC的研究重点将从量化计数转向分子分析。根据分子特征识别可以接受特定治疗的患者亚群，彻底改变了人们对PCa的理解和治疗。CTC 检测可以预测PCa 的进展和预后，并更有效地确定合适的精准治疗方案，在PCa 诊断和治疗中发挥重要作用，是PCa最具前景的无创检测技术之一。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突