银杏内酯鼻喷制剂对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

钱欣颖 梁学亚 蒋 薇 李志勇

（成都百裕制药股份有限公司创新药研究院生物部，四川 成都，610000）

缺血性中风，是脑血管疾病中比较常见的一种疾病，致残率和致死率很高，是为患者和社会带来沉重负担的疾病之一[1-2]。大脑动脉（尤其是大脑中动脉）闭塞会导致缺血性中风，引起一系列神经毒性事件，包括氧化损伤[3]、自噬[4]、血脑屏障通透性增加和功能障碍[5]、炎症途径[6]及钙超载[7]等，最终导致神经元和脑细胞的死亡。鼻腔给药是一种便捷的给药方式，活性成分可经鼻黏膜迅速吸收，作用于鼻腔局部和全身，此外，还可直接将药物传递至大脑[8]。与口服或静脉给药相比，鼻腔给药具有包括非侵入性、自我给药以及高生物利用度等优点，是近些年来制剂学领域研究的热点之一[9-10]。许多中枢神经系统相关疾病已经通过鼻腔给药治疗，如帕金森、阿尔兹海默症、癫痫、成瘾等[11]。鼻腔给药治疗脑缺血已有一定研究基础。YANG J P 等[12]证实了鼻内给药重组人VEGF 可减少梗死体积，改善行为恢复，并增强脑血管生成。杨开清[13]用脑醒喷鼻剂治疗急性缺血型中风，该药能显著改善脑缺血，减轻自由基损伤，保护脑细胞。银杏内酯和白果内酯的神经保护作用已在多个临床前研究中得到验证[14-17]。金阁莱®（银杏内酯注射液）是由白果内酯、银杏内酯A、B、C等组成的天然药物注射液，是唯一兼具拮抗血小板活化因子及保护神经血管单元的分子复方药物，其安全性和有效性已在临床得到证实。为了进一步提高金阁莱有效药物成分的临床使用便利性、增加患者依从性，因此，本研究主要探究鼻内给予银杏内酯鼻喷制剂在脑缺血再灌注损伤方面发挥的保护作用。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF 级6～8 周龄的SD 大鼠，雄性，体质量220～250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（浙）2019-0001，合格证编号：20210316Aazz0619000800]提供。大鼠饲养在屏障内，内部环境温度为（22±2）℃，环境湿度范围为40%～70%，12 h 昼夜循环，动物自由饮用水和饲料，适应环境1 周左右开始实验。

1.2 药品与试剂

银杏内酯鼻喷制剂由成都百裕制药股份有限公司与健乔信元医药生技股份有限公司（中国台湾）合作研究和开发。阳性药物依达拉奉（生产企业：先声药业集团有限公司，生产批号：86-200802）。氯化三苯基四氮唑（生产企业：北京西浓科技，生产批号：409E033）。多聚甲醛（生产企业：科隆化工，生产批号：2019052001）。甲醇(HPLC 级)购自Merck kGaA。

1.3 仪器设备

电子天平（生产企业：德国赛多利斯，型号：SECURA225D-1CN）、小动物安乐死系统（生产企业：上海玉研科学仪器厂，型号：LC-500-S1）、高速冷冻离心机（生产企业：四川蜀科仪器厂，型号：TGL-16）、高效液相色谱系统（生产企业：日本 SHIMADZU，型号：LC-20AD）、四极杆离子阱质谱仪（生产企业：美国 Applied Biosystem，型号：API 4000）。

2 实验方法

2.1 药代动力学测定

通过高效液相色谱-质谱(LC-MS/MS)法检测大鼠血浆含有的银杏内酯鼻喷制剂的药物浓度。SD 大鼠鼻腔滴注（IN）10 mg/kg 银杏内酯鼻喷制剂，分别在0、0.25、0.5、1、2、4、8 h 各时间点麻醉取全血，离心得到血浆，向含25 μL 的空白血浆（标准曲线样品、质控样品）或待测血浆样品的96 孔板中加入25 μL 标准样品系列溶液、质控溶液或甲醇，再加25 μL 内标工作液，最后加200 μL 甲醇，涡旋震荡3 min，在3 800 rpm/min 条件下进行15 min 离心处理，用移液枪吸取上清液200 μL 进行LC-MS/MS 检测药物浓度。

2.2 动物药效实验

2.2.1 动物分组及给药方式

筛选35 只健康状态良好的雄性SD 大鼠，按照体质量对其进行分组，设置假手术组（5 例），脑缺血再灌注模型组（10例）、依达拉奉阳性对照组（6 mg/kg）（10 例）、银杏内酯鼻喷制剂组（10 例）。所有动物在复灌后即刻首次给药，阳性对照依达拉奉组尾静脉注射，连续给药3 d；银杏内酯鼻喷制剂组滴鼻给药，造模当天给药1 次，之后给药2 次/d，共给药3 d，具体操作为将动物保持仰卧姿势，药物通过右鼻孔滴注100 μL，左鼻孔不给药[18]。模型组与假手术组经鼻给予同体积的溶媒。

2.2.2 大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注（MCAO）模型构建

给药组与模型组大鼠按7 mL/kg 腹腔注射6%的水合氯醛麻醉，在手术台上保持仰卧姿势。大鼠颈部正中偏右剪开皮肤，做大约1.5 cm 长的切口，分离暴露右侧颈总动脉，沿颈总动脉远心端将颈内外动脉分离，在颈外动脉处做切口，沿颈内动脉插入线栓，有明显阻力感立即停止插入，缺血2 h后，将线栓完全取出，实现缺血再灌注。假手术组动物用6%水合氯醛麻醉后，仅分离暴露颈总动脉，不做中动脉栓塞处理。在整个操作过程中，使用加热垫和加热灯将大鼠体温保持在（37.0±0.5）℃。

2.2.3 观察指标

（1）神经功能评分：通过Longa 评分法对大鼠在经过24 h 的缺血再灌注后的神经症状进行评分[18]。评分结果划分成5 个级别，级别越高，代表神经功能受损越严重，详细的评分标准，见表1。

表1 Longa 评分表

（2）脑梗死面积检测：大鼠缺血再灌注72 h 后，将大鼠置于二氧化碳安乐死箱中进行安乐死，将提前预冷的PBS 溶液灌注心脏，迅速取各组动物脑组织，除去小脑、嗅球、低位脑干部分，沿冠状切面切成厚度约2 mm 的6 片脑部切片，轻轻置于1%的TTC 溶液中，37 ℃水浴30 min，期间用镊子轻轻翻动，经染色后正常脑组织呈现红色，梗死组织区域不会被染色（呈现苍白色），用图像分析软件对每个切片上的梗死区域进行划分和分析，计算脑梗死面积百分比，脑梗死面积百分比（%）= 脑右侧梗死面积/全脑面积×100%。

（3）相对脑含水量检测：大鼠缺血再灌注后72 h 后进行安乐死，取脑组织，即上述脑梗死面积检测组织，在TTC 染色前准确称取脑组织湿重，TTC 染色后将组织放于60 ℃恒温干燥箱中烘烤24 h，干燥后准确称取脑组织干重，按照干湿重法对大鼠的相对脑含水量进行计算，公式为：相对脑含水量测试组=［（脑组织湿重-脑组织干重）测试组-（脑组织湿重-脑组织干重）假手术组］

3 统计学分析

采用EXCEL 和SPSS 22.0 进行数据统计分析，计数资料以（±s）表示，采用Graph Pad Prism 8 软件对不同组别动物给药后的参数进行绘图。数据进行方差齐性检验，当方差齐时P＞0.05，采用单因素方差分析（ANOVA）中的Dunnett's &LSD 法对组间差异进行比较。当方差不齐时P＜0.05，通过Kruskal-Wallis H 秩和检验（K-W 法）里面的Mann-Whitney U 检验（M-W 法）完成组间差别分析。通过WinNonlin 8.3 软件对药动学参数进行求取。

4 实验结果

4.1 鼻腔滴注药代动力学

SD 大鼠鼻腔给予10 mg/kg 银杏内酯鼻喷制剂后在不同时间点进行采血，对银杏内酯鼻喷制剂内含的主要成分，即白果内酯与银杏内酯B 进行检测，具体药代动力学参数见表2。其中，白果内酯和银杏内酯B 的半衰期t1/2分别为2.70 h 和8.04 h，给药时曲线下面积AUCall分别为3 046 ng/mL 和1 257 ng/mL，药物达峰时间tmax分别为2 h 和0.333 h，结果表明药物可通过鼻腔系统迅速吸收进入全身，且具有较好的药代特征。

表2 大鼠鼻腔给药银杏内酯鼻喷制剂10 mg/kg 的药代动力学参数(n=10)

4.2 银杏内酯鼻喷制剂对大鼠Longa 神经行为学评分的影响

建模24 h 之后，假手术组大鼠除因外科手术创口导致活动略微减少外，未见明显异常症状；其余各组动物出现不同程度的体质量下降，活动减缓，对侧前爪屈曲、行走时身体向对侧偏倒或者无法自发行走，对所有组大鼠进行Longa 神经行为学评分。Longa 评分结果见表3 和图1，模型组评分为（2.92±0.19）分，依达拉奉组为（2.20±0.25）分，银杏内酯鼻喷制剂组为（2.09±0.09）分。与假手术组相比较，模型组评分显著升高（P＜0.001），动物表现出明显的运动行为缺陷，表明建模成功。与模型组相比，依达拉奉组、银杏内酯鼻喷制剂组运动行为缺陷减少，神经功能缺损评分降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且银杏内酯鼻喷制剂组与依达拉奉组评分相当或更低。

图1 银杏内酯鼻喷制剂对大鼠Longa 神经行为学评分的影响

表3 各组动物Longa 神经行为学评分统计结果 （±s，分）

表3 各组动物Longa 神经行为学评分统计结果 （±s，分）

注：与假手术组相比，***P＜0.001；与模型组相比，#P＜0.05。

4.3 银杏内酯鼻喷制剂对大鼠脑梗死面积的影响

造模72 h 后，模型组大鼠右脑部位出现了明显的梗死灶，依达拉奉组和银杏内酯鼻喷制剂组出现不同程度的梗死灶。TTC 染色结果显示，模型组动物脑梗死面积百分比为（24.78±1.72）%，与假手术组（0.00±0.00）%相比显著升高（P＜0.001）；给予依达拉奉后，脑梗死面积明显减小，百分比为（10.89±1.57）%，差异有统计学意义（P＜0.001）；银杏内酯鼻喷制剂组脑梗死面积百分比为（20.57 ±1.40）%，与模型组相比虽差异无统计学意义（P＞0.05），但仍表现一定降低脑梗死面积的作用，见图2。

图2 银杏内酯鼻喷制剂对大鼠脑梗死面积的影响

4.4 银杏内酯鼻喷制剂对大鼠脑水肿的影响

实验终点，检测各组动物相对脑含水量（g），结果显示，模型组大鼠与假手术组的相对脑含水量分别是（0.20±0.03）g与（0.00±0.03）g，模型组明显更高，两者相比差异有统计学意义（P＜0.001）；给予银杏内酯鼻喷制剂和依达拉奉可明显减少相对脑含水量，脑相对含水量分别为（0.12±0.03）g 和（0.13±0.03）g，与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。实验结果表明银杏内酯鼻喷制剂对大鼠MCAO 模型中的脑水肿有良好的改善作用，在该指标上与阳性依达拉奉相当，见图3。

图3 银杏内酯鼻喷制剂对大鼠脑水肿的影响

5 讨论

许多临床前研究已经验证了银杏内酯与白果内酯对于缺血性中风的细胞和信号事件的作用，包括炎症途径和神经保护。本研究中的银杏内酯鼻喷制剂主要成分为银杏内酯A/B/C/J（总占比为52%～64%）、白果内酯（占比为36%～48%）。以往研究结果表明，对小鼠tMCAO 模型腹腔注射给予3.5 mg/kg 银杏内酯注射液，能显著改善模型急性期临床症状，主要机制为通过抑制模型发展过程中的炎症因子和炎症小体进而发挥保护作用[19]。同样，在大鼠MCAO 模型上同样证明了银杏内酯注射液和其内部主要成分银杏内酯B 与白果内酯在急性脑缺血性脑损伤方面的治疗作用，其机理可能和突触后致密蛋白的浓度发生改变有关[20]。

为了提高临床的使用便利性和患者的依从性，我们探索开发银杏内酯的鼻喷制剂。由于鼻喷剂用药方便、适合扩展国际市场等多方面优势，在中风、创伤后应激综合征、镇静抗焦虑及血管性痴呆等适应证方向具有较高的应用价值。基于相关制剂体系，采用不同比例和类型的增溶剂、抗菌防腐剂、阳离子螯合剂、增稠剂、助悬剂、渗透压调节剂、表面活性剂和溶剂等，制备了多种制剂配方，最终筛选得到的鼻喷剂处方可以达到10 mg/mL 的载药浓度。大鼠鼻腔滴注银杏内酯鼻喷制剂的药代动力学数据也很好证明了药物可通过鼻黏膜吸收迅速进入体内，具有一定的暴露，且银杏内酯B 的半衰期可达到8 h。

在实验性中风研究中，大脑中动脉闭塞（MCAO）被认为是模拟人类缺血性中风的最佳模型之一，并在大鼠和沙鼠上有大量研究[21]。本研究中，采用线栓法构建大鼠脑缺血再灌注损伤模型，以依达拉奉为阳性对照，缺血再灌注后，鼻内滴注银杏内酯鼻喷制剂能改善神经功能损伤，减小脑梗死面积，改善脑水肿，表明银杏内酯鼻喷制剂对实验性的局灶性脑缺血再灌注模型在急性发作期间的受损具有显著的保护作用，是一种潜在的治疗方案。