气质联用法测定苯胺灵残留量实验教学

张璐薇， 李珂嘉， 王鸿伟， 赵 宏， 彭锦峰

（西安交通大学仪器科学与技术学院，西安 710049）

0 引言

“食品化学”是食品科学与工程专业最主要的专业基础课和相关学科的骨干课程之一［1］。就我校开设的食品测控技术与仪器专业方向而言，食品化学课程为多学科交叉中——食品工程专业模块的核心课程。该课程主要从化学和分子水平角度讲述与食品有关的化学知识，包括食品中的营养素、添加剂、风味成分、有害物质等相关知识，是一门理论联系实际较强的课程［2］。随着我国在2016 年正式加入国际工程联盟的“华盛顿协议”，国内工科高校的本科教学更加重视创新能力和工程实践能力的培养，而实验教学是培养学生创新意识和实践能力的重要环节［3］。根据本专业方向培养学生的要求和目标，将食品化学和现代仪器分析两门专业课程进行紧密结合，特开设了蔬菜中农药苯胺灵残留量的测定——气相色谱-串联质谱法实验。

农药是农业生产中必不可少的生产资料，在生物灾害防治和粮食增产中发挥着重要作用［4］。农药的滥用和过量使用会造成环境污染与农药残留超标，进而对人类产生急性或慢性的毒害作用［5］。苯胺灵（N-苯氨基甲酸异丙酯）是一种土壤除草剂，主要用于大豆、甜菜、棉花、蔬菜、烟草地中防、除一年生禾本科杂草。作为苯胺类的除草剂，它的毒性比较大，若进入人体，易通过血脑屏障而与含大量类脂质的神经系统发生作用，从而损害神经系统［6］。开展农产品中的农药残留分析及相应的监管是保障消费者食品安全的重要手段，受到各国政府及公众的广泛关注［7］。因此，采用气相色谱-串联质谱法对农药苯胺灵进行残留量的测定，为评估带有苯胺灵的膳食摄入风险提供科学依据。实验过程包括样品制备、提取、净化、浓缩、上机测定及数据处理等复杂流程，耗时长，步骤繁琐。如何让学生在实验过程中做到心中有数、有条不紊是实验教学过程中需要关注的重点问题，既使学生掌握了分析仪器的原理及实验操作规范，又加强对食品安全法规的理解及运用。基于此，本文建立了详细的标准操作规程，对关键步骤进行了总结归纳，提出了“4-3-2-1”的样品前处理流程，从试剂耗材清单准备到样品前处理、上机分析测定及实验数据处理，进行了全方位的规定，在实际操作过程中，重点讲授学生应特别注意的关键步骤，结合最终实验结果，分析关键步骤对实验结果的影响，从而使学生养成“粗细结合，关注核心”的食品测控技术实验习惯。

1 实验内容与步骤

1.1 实验主要内容

为建立气相色谱-质谱联用法测定蔬菜中苯胺灵（除草剂）残留量的分析方法，采用Rtx-5 色谱柱（30 m×0.25 mm ×0.25 μm）进行分离，质谱以选择离子扫描模式进行检测，同位素外标法定量，对100 mg／L的标准品进行加标回收实验。在优化的条件下，苯胺灵在0.5 ～10 mg／mL范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9997。样品加标平均回收率为75% ～110%。本实验的开设不但可简便、快速、准确对蔬菜中苯胺灵残留量进行测定，也可使学生掌握样品前处理过程与气相色谱质谱联用技术及方法，加深对这一新型分析仪器与检测原理的认知。

1.2 样品前处理规程

样品前处理需按“4-3-2-1”流程进行，即4 份样品制备（2 份平行样+2 份加标样）、3 次提取、2 次氮吹浓缩、1 次净化。这些环节相对独立又相辅相成，每个环节都很重要，如果其中某个步骤出现失误，则会影响整个实验的准确性，造成实验加标回收率过高或过低，从而无法验证实验方法的可靠性。学生虽然有生命科学导论、无机与分析化学、有机化学等基础实验操作经验，但第一次接触专业实验，存在实验试剂、仪器较陌生，基础操作薄弱等问题，实验中又涉及农药、挥发性有机溶剂等，相较之前的基础科学类实验，本实验更复杂、操作步骤繁琐、注意事项较多且具有一定危险性，加上操作不熟悉，很容易在实验过程中出现人为因素导致的数据不准确，从而对实验结果有影响。为了培养学生具备扎实的食品质量与安全理论基础，降低失误率，保证实验教学质量，促进实操素质提升，需要对实验进行合理统筹规划，严格按照实验规范——标准操作规程（Standard Operating Procedures，SOP）进行，易出错环节进行重点讲解与提醒，使学生主观上更细心，有条不紊地合理构思，有利于培养严谨认真的科学实验态度，为培养高素质的应用型人才奠定必要的实验操作基础，从而实现培养具有国际视野的食品安全领军人才及卓越工程师这一目标。

1.3 实验材料与仪器

（1）原材料。新鲜青菜（市售）。

（2）试剂。苯胺灵、乙酸乙酯、正己烷、ProELut CARB石墨化碳黑小柱、氯化钠等。

（3）实验仪器与设备。气相色谱仪（聚光科技GC-2000）、质谱仪（聚光科技MS-6100）、离心机（湘仪H1850R）、超声波提取机（KQ-500 VDE 型）、固相萃取仪（AG-SPE-12D）、氮吹浓缩仪（MD 200）、涡旋混匀仪（SCILOGEX MX-S）等。

1.4 实验操作步骤

实验检测流程如图1 所示。

图1 实验检测流程图

（1）配制标准样品。称取适量苯胺灵标准品，用乙酸乙酯定容至10 mL，得到1000 mg／L 的苯胺灵标准储备液，用乙酸乙酯稀释至质量浓度为100 mg／L标准工作液，再空白基质溶液逐级稀释至10、5、1、0.5、0 mg／L，制得标准品STD（standard的缩写），并分别标注STD 100、STD 10、STD 5、STD 1、STD 0.5 及STD 0，待测。以苯胺灵质量浓度为横坐标，对应的质谱峰面积为纵坐标，绘制基质标准曲线［8］。标准液配制过程中，注意移液器的使用方法及注意事项，在添加溶液后需及时更换枪头以及涡旋混匀。该环节使用移液枪严格按规定添加，即实验要求中的“细”即细心、仔细。

（2）样品前处理。将市售青菜制样加工成浆状，制备成试样甲、试样乙（留样、冰箱冷藏）。试样甲放入离心管中，加入NaCl进行盐析。由于仅对试样中的有机相进行萃取提取，在称样时，允许一定误差，即“粗”环节，达到有的放矢。

（3）样品中农药残留的提取。包含添加提取液、涡旋、超声、离心、提取有机相等步骤，该过程较复杂且重复3 次，对操作要求较高，需耐心、谨慎在通风橱内进行，最后对提取液进行加温氮吹浓缩。

（4）样品净化。需使用固相萃取仪及真空泵，利用固相萃取小柱对目标分析物进行分离、纯化后，进行二次氮吹将浓缩液转移至GC-MS 进样瓶（GC-MS 气相色谱质谱联用仪），编辑进样程序并选择分析方法进行上样测定。

（5）上样测定，数据处理。气相色谱仪将复杂混合物试样各组分分离后，依次流入气相色谱仪，并顺序进入质谱系统，经质谱分析检测后，计算机控制系统进行数据采集、处理、传递并存储［9］。仪器分析结束后，生成质谱图，借助美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）标准库匹配检索得到目标物的保留特征及特征碎片离子。

2 实验过程及保障措施

2.1 实验教师课前准备

GC-MS是一种结合气相色谱和质谱的特性，用于复杂和痕量样品的检测，其主要应用于工业检测、食品安全、环境保护等众多领域，如农药残留、食品添加剂等。气相色谱-质谱技术可以准确有效地完成复杂样品的定性与定量分析，在检测过程中依托进样系统、质量分析器、检测器等组件的应用，强化对目标物的检测效果，排除相关因素的干扰，提升检测工作的有效性［10］。农药在样品中的残留是痕量水平，待测样品的成分复杂，如何去除背景值的干扰、保证目标化合物的响应以及保护分析仪器是农药残留分析的核心问题［11］。实验教师需要根据目标分析物，参照国家标准及实验条件，建立气相色谱-串联质谱测定农药中苯胺灵残留量的分析方法并对实验结果进行分析，对方法可靠性进行验证。

2.1.1 实验仪器的调试、预实验

由于气相色谱质谱联用仪属于大型精密仪器，每次开课前，实验教师需要进行预实验，建立检测方法，熟悉操作，调试设备及实验结果验证等工作。此外还需制作原理简单明了、知识点清晰、注意事项明确的PowerPoint（PPT）课件以及参照国家标准《GB 23200.61-2016 食品安全国家标准食品中苯胺灵残留量的测定气相色谱-质谱法》，编写实验步骤明确的标准操作规程（SOP）以保障学生实验顺利进行。

2.1.2 实验耗材准备及化学品的配制

购买市售新鲜蔬菜（青菜）；提供给学生足够的实验耗材如一次性吸管、固相萃取小柱（Solid Phase Extraction，SPE）、2 mL GC-MS进样瓶等。所用不同种类试管需要提前超声洗涤，超纯水冲洗后，烘箱烘干，置于试管架上，应准备1.5 倍的试管数量备用。除此之外，实验需要的试剂量较大，包括苯胺灵标准品、乙酸乙酯、乙酸乙酯-正己烷（1 +1，V／V）等，实验指导教师需提前配制备用。

2.2 按小组进行实验

为保证教学效果及规范操作，实验分组进行，每组为5 人，给予每组人员足够的实验空间，实验教师1∶1组进行指导确保实验质量，同时也提高了实验的安全性。此外，实验中样品制备（平行样与加标样）及标准品配制同时进行，需要同学们相互配合；超声、离心配平也需互相提醒注意事项；2 次氮吹浓缩因时间较长，轮流操作，从而共同协作完成实验，发挥团队合作精神。

2.3 教师示范关键实验步骤

扎实的实验基本技能是保证学生安全完成实验的条件，也是学生在以后工作中实现新突破的基础［12］。实验开始前，进行系统安全培训教育，特别强调规范操作及喷淋、洗眼装置、消防器材及逃生通道具体位置，以确保实验过程中人身安全。

有机相提取和目标分析物富集是整个实验的重点部分，也是难点，对学生操作技术要求较高，实验也有一定的危险性，这就要求实验指导教师要熟悉操作，并就实验过程中可能出现的问题提前叮嘱学生，关键步骤要亲自示范，避免不必要事故的发生［13］。

离心机初次使用，由指导教师示范配平、对位摆放、离心转子及程序选择原则；对固相萃取小柱预淋洗活化过程、固相萃取仪的使用、初次氮吹过程由实验教师亲自示范，气瓶、减压阀等进行详述，使学生加深理解，随后进行实际操作。提取及氮吹步骤均在通风橱内进行，特别强调通风橱活动挡板拉至离台面15 cm以下，避免易挥发气体对人体的伤害。

2.4 落实实验安全措施

本实验使用苯胺灵农药标准品、大量有机溶剂等，具有挥发性，因此要求所有实验环节，尽可能在通风橱中进行。强调实验安全，不要近距离吸入有机挥发性气体。

标准品配制前，需要学习并反复练习移液枪的使用及移液操作，操作熟练后方可进行移液进行5 个标准品的配制。特别强调每配制完一份标准品务必注意移液枪枪头的更换以及使用涡旋混匀仪以保证标准品准确、均匀、彻底混合。

提取溶剂的选择苯胺类除草剂易挥发、难溶于水、易溶于有机试剂［14］。本实验采用乙酸乙酯-正己烷（1∶1，V／V）进行提取，3 次提取过程，每次尽可能收集、提取全部有机相后，超声时水温升高使离心管内有机相挥发气化体积膨胀，易使离心管盖崩开，因此严格要求学生佩戴个人防护用品（Personal Protect Equipment，PPE）如实验服、丁腈手套、护目镜等，同时超声机中放入适量冰袋，降低样品温度以减少气体挥发。取出离心管置于离心管架时，要求轻拿轻放，切勿瓶口对人。

由于是初次使用离心机，需特别注意离心机转子不同所对应程序不同，设置对应的转子程序、带盖配平、对位放置，设置所需转速、时间、离心温度等条件后启动，以保证离心机正常工作运转。

由于初次接触氮气气瓶，学生会有些许畏惧，教师演示如何开启、关闭气瓶及讲述减压阀的作用、氮吹仪的原理及使用，鼓励学生实际动手操作，将理论联系实际加深印象。

使用固相萃取仪及无油真空泵进行萃取时，注意先进行石墨化碳黑固相萃取小柱的预淋洗活化以及萃取后待分析物的洗脱，实验中注意吸管的使用，保证所有提取的有机相都通过SPE小柱后收集至试管中。

以上各环节，需要实验指导教师对每个细节反复强调，加深印象，稍有不慎，高灵敏的实验结果数据会产生误差。实验整个过程，严格遵守食品化学实验室各项安全规章制度，并按SOP 标准操作规程严格操作。

2.5 重视实验过程

本实验将先进仪器技术转化为实验教学资源，把科研意识的培养融入实验教学过程，实现科研与教学的交互和融合，一方面使学生在实验过程中充分了解前沿的科研成果及实验方法；另一方面还锻炼了学生的科学思维能力及探索创新能力［15］。实验涉及农药等化学品，且实验操作较为繁琐，细节等所需注意事项较多，且使用造价昂贵的大型精密仪器进行实验，学生有所畏惧，不敢着手进行操作实施。第一步即使用移液枪进行标准品配制，由于不熟悉操作，失误频繁发生，学生心理上负担较重，更易手忙脚乱，影响实验进程。此时，教师应以鼓励为主，语气平缓，耐心并合理解释该实验难度，强调熟能生巧，逐渐缓解学生紧张情绪。每完成一个标准品的配制，方式方法上鼓励学生为主，以增强自信心，熟悉操作后，实验顺利进行，充分激发了学生的成就感，对后续操作更加细致认真投入。

4 个样品（2 平行样+2 加标样）通过二次氮吹浓缩制备完成后（过程约5 h），需使用自动进样器、气相色谱质谱联用仪进行进样及分析检测。进样前，实验教师再次讲授GC-MS 原理及设备，对照实物讲解，极大地提升学习兴趣，加深印象。学生通过GC-MS数据采集软件，自行编写进样序列，逻辑上得到充分锻炼，进样器按照所编序列自动进样，学生也获得极大成就感。GC-MS运行后，学生也认真仔细观察进样口温度、驻温箱升温过程、保留时间及谱图等仪器分析过程。

2.6 养成良好的实验习惯

实验结束后，养成良好的习惯，主动打扫卫生，进行实验室清理工作；废液分别入有机、无机废液桶，实验室固体废物如使用过的枪头、一次性吸管等投入危险废物垃圾，增强环保意识，提高自身的素质，提升科学实验观。设备使用完毕所有器材归位，拔掉设备电源插头等，减少安全隐患的同时，培养学生实验室安全意识，为今后研究生阶段实验室安全操作打下良好的基础。

2.7 加强对实验结果分析能力的培养

由于每个样本需要分析测试30 min，标准品5 个，样品4 个，再加上降温程序，设备单次运行5 h 左右，学生对结果进行分析并独立完成实验报告。实验要求学生独立使用GC-MS数据分析软件，操作并读取离子谱图数据，根据标准品浓度及积分峰面积值制作校正曲线，通过外标法对样本进行定量分析并计算相应加标回收率；从实验操作人员自身（人）、测试过程中用到的仪器设备（机）、所用到的试剂与耗材（料）、所选择的检测方法（法）、实验操作各个环节（环）5 个方面对影响样品中农药残留量检测准确性因素进行分析；仪器分析测定流程中在仪器装置、方法等方面提出改进与创新的建议。若实验加标回收率偏差较大，还需加以分析，总结实验失败的原因。实验报告要求填写实验关键性证据、数据分析、质谱图、思考题等，任务布置上结构合理，加强实验知识的掌握。

3 结语

气相色谱-质谱法测定蔬菜中苯胺灵残留量，该实验时间长、流程复杂、步骤多、综合性强、实验难度较大，但可以大大提升学生动手实操能力、统筹规划能力、团结协作能力，以及逻辑能力等。对实验指导教师要求较高，不仅具备专业知识，还需有爱心，耐心、细心和责任心，实验中不仅指导学生还要鼓励学生，以增强学生自信心。通过该实验，认识、使用并了解色谱仪、质谱仪等大型仪器的工作原理，在之后的专业实习过程中，再次接触到此类设备时，学生们普遍反映熟悉设备操作并加深了对分析仪器原理的理解。通过该实验，促进了学生实验技能提升的同时，也加强了实验室安全意识，提高分析及解决问题的能力并学会对实验进行总结，为今后科研阶段打下坚实的实验操作基础。