发状分裂增强子1对胆固醇刺激下内皮细胞的影响及机制研究

何春艳,裴美娟,李玉明,王会荣

(1.武警特色医学中心神经内科,天津 300162;2.武警特色医学中心心血管疾病研究所,天津 300162;3.宝鸡市人民医院神经外科,陕西 宝鸡 721000)

动脉粥样硬化性心脑血管疾病是当前全球范围内发病率较高的疾病之一,血浆中低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)浓度与心脑血管疾病的发生有直接关系[1-3],但是当前的药物治疗手段有限。一项纳入25317例接受至少1种降脂药物治疗至少3个月的中国血脂异常患者的多中心、横断面、非干预性流行病学研究[4]显示,根据《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》标准,全体患者LDL-C达标率仅为37.3%,仅有26.9%极高危患者LDL-C达标,中国大部分血脂异常患者,特别是高危和极高危的患者,接受以他汀单药治疗为主的降脂治疗后血脂仍无法达标。因此寻找新的药物治疗靶点对开发新的治疗方案具有重要意义。发状分裂增强子1(Hairy and enhancer of split homolog-1,HES-1)属于前神经元碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族成员之一,在调节细胞分化/增殖中发挥重要作用[5-6],但是HES-1对血管内皮细胞的调节作用,特别是在高胆固醇刺激下发挥的作用以及潜在的作用通路尚不明确。因此,本研究通过构建HES-1抑制和过表达模型,检测在胆固醇刺激下HES-1对细胞凋亡和血管生成相关分子表达的作用,并观察无翼型MMTV家族整合位点(Wingless type MMTV integration site family member,Wnt)/磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)/β-连锁蛋白(β-catenin)信号通路的变化,为高胆固醇血症的治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与试剂 Ea.hy926细胞(GNHu39)来自中国科学院典型培养保存委员会的细胞库;胎牛血清(FBS,12484-028)和高糖Dulbecco改良Eagle’s培养基(H-DMEM,11965-092)购自美国Thermo公司;胆固醇(C4951)购自美国Sigma公司;抗-HES-1(ab108937)、Wnt(ab15251)、AKT(ab8805)、p-AKT(ab38449)、β-catenin(ab32572)、c-myc(ab32072)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2,ab196495)、Bcl-2相关X蛋白(Bax,ab32503)、Bcl-2相互作用细胞死亡介质(BIM,ab32158)、p-BIM (ab17935)、半胱天冬酶9(Caspase-9,ab32539)、Caspase-3(ab13847)抗体和转化生长因子-β(TGF-β,ab119558)、胰岛素样生长因子(IGF,ab239424)、血管内皮生长因子α(VEGF-α,ab100786)、血小板衍生生长因子(PDGF)ELISA试剂盒均购自英国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞模型构建:用PCR方法从细胞中克隆HES-1的cDNA并将HES-1片段克隆到载体中,转染Ea.hy926细胞48 h后用1000 μg/ml G418筛选稳定的HES-1过表达细胞。构建HES-1基因敲除载体,用2 μg/ml puro筛选稳定的HES-1基因敲除细胞。

1.2.2 细胞分组:将细胞分为CH组(胆固醇刺激)、GO组(HES-1过表达+胆固醇刺激)、GD组(HES-1低表达+胆固醇刺激)和NC组(空白对照组),其中,CH组、GO组、GD组给予100 mmol/L胆固醇刺激24 h,NC组不给予任何干预。

1.2.3 蛋白质印迹分析:配制4%浓缩胶和1×跨膜缓冲液4 ℃备用。应用细胞破碎仪破碎细胞后进行蛋白定量,随后将蛋白样品置于100 ℃恒温孵育器中充分变性。经过电泳、转膜、封闭和抗体孵育后进行显影和分析,以GAPDH为内参蛋白,计算目的蛋白相对表达量。每个实验独立重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测:将每组细胞接种到100 mm平板中培养,细胞贴壁过夜后抽吸培养基,每孔用PBS冲洗2次。用胰蛋白酶收集细胞。室温下以300 g离心细胞5 min,去上清液,在100 μl 4%多聚甲醛的PBS中重新悬浮,室温孵育10 min。再次离心细胞,并将每组细胞与Annexin V在室温下孵育15 min,继而用PI孵育5 min,随后进行检测。

1.2.5 酶联免疫吸附试验:制备1∶100捕获抗血清,将50 μl稀释捕获抗血清分配到96孔板中,在4 ℃条件下孵化过夜。次日弃去孔内液体,用裂解缓冲液清洗4次。在每孔中加入1%牛血清白蛋白300 μl封闭,室温下孵育1 h。将50 μl裂解后的细胞悬液分配到适当的孔中,室温下孵化1 h。偶联稀释液中配制成1∶5000的稀释度,每孔分配50 μl,室温下孵化1 h。每孔加入125 μl Turbo-TMB,室温下显影约15 min,或直到阴性对照开始变为蓝色。每孔中加入0.9 mol/L硫酸125 μl停止反应。立即在平板阅读器/分光光度计上读取OD450数值,计算TGF-β、IGF、VEGF-α和PDGF的浓度。

2 结 果

2.1 HES-1差异表达细胞模型鉴定 CH组、GO组和GD组细胞在胆固醇刺激前HES-1表达水平分别为1.22±0.09、1.46±0.11和0.47±0.04。与CH组比较,GO组HES-1表达显著增加,GD组HES-1表达显著降低(均P<0.05),提示细胞模型建立成功。

2.2 各组细胞凋亡占比比较 NC组、CH组、GO组和GD组凋亡细胞占比分别为(0.03±0.01)%、(36.03±3.21)%、(56.73±5.48)%和(20.03±2.03)%。与NC组比较,所有胆固醇处理组凋亡细胞占比显著增加(均P<0.05)。与CH组比较,GO组凋亡细胞占比显著增加(P<0.05)。

2.3 各组细胞凋亡相关蛋白表达水平比较 见表1。与NC组比较,CH组和GO组Bax、Caspase-3、Caspase-9、p-BIM/BIM表达显著升高,Bcl-2表达显著降低(均P<0.05);GD组Bax、Caspase-9表达显著升高,Bcl-2、Caspase-3表达显著降低(均P<0.05)。与CH组比较,GO组Bax、Caspase-9表达显著升高,Bcl-2表达显著降低(均P<0.05);GD组Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、p-BIM/BIM表达显著降低(均P<0.05)。与GO组比较,GD组Bax、Caspase-3、Caspase-9、p-BIM/BIM表达显著降低(均P<0.05)。

表1 各组细胞凋亡相关蛋白表达水平比较

2.4 各组细胞血管生成相关因子表达水平比较 见表2。与NC组比较,CH组和GO组TGF-β、IGF、VEGF-α、PDGF表达显著降低(均P<0.05);GD组PDGF表达显著降低(P<0.05)。与CH组比较,GO组TGF-β、IGF、VEGF-α、PDGF表达显著降低(均P<0.05);GD组TGF-β、IGF、PDGF表达显著升高(均P<0.05)。与GO组比较,GD组TGF-β、IGF、VEGF-α、PDGF表达显著升高(均P<0.05)。

表2 各组细胞血管生成相关因子表达水平比较(pg/ml)

2.5 各组细胞Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平比较 见表3。与NC组比较,CH组HES-1表达显著升高,p-AKT/AKT、c-myc表达显著降低(均P<0.05);GO组HES-1表达显著升高,Wnt、p-AKT/AKT、β-catenin、c-myc表达显著降低(均P<0.05);GD组HES-1、Wnt、β-catenin、c-myc表达显著降低,p-AKT/AKT显著升高(均P<0.05)。与CH组比较,GO组HES-1表达显著升高,Wnt、p-AKT/AKT、β-catenin、c-myc表达显著降低(均P<0.05);GD组HES-1、Wnt、β-catenin表达显著降低,p-AKT/AKT、c-myc表达显著升高(均P<0.05)。与GO组比较,GD组HES-1表达显著降低,Wnt、p-AKT/AKT、β-catenin、c-myc表达显著升高(均P<0.05)。

表3 各组细胞Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平比较

3 讨 论

动脉粥样硬化是由动脉内膜胆固醇过度沉积引起,可导致心肌梗死、中风和周围动脉疾病的发生[7-9]。临床试验和动物模型研究[10-12]均发现血浆中胆固醇浓度与心脑血管疾病发生率间存在直接相关性,但其发病机制尚未完全阐明,新的治疗策略仍有待进一步研发。

HES-1在多种细胞进程中均发挥重要作用,但是其表达差异对胆固醇刺激下的血管内皮细胞的影响及其潜在作用通路尚不明确。在细胞凋亡方面,本研究发现胆固醇刺激可促进血管内皮细胞中凋亡相关基因表达,并显著激活细胞凋亡过程,当HES-1过表达时凋亡相关蛋白表达增加,保护蛋白表达水平降低,细胞凋亡水平亦增加,敲除HES-1可抑制内皮细胞凋亡。这与康丽丽[13]的研究结果类似,其发现西地那非可通过抑制HES-1表达,抑制肺动脉平滑肌细胞凋亡。在血管生成方面,本研究发现胆固醇刺激可抑制血管生成相关因子表达,敲除HES-1可改善胆固醇对血管生成因子的影响,提示HES-1过表达会抑制血管生成,敲除HES-1对血管生成具有保护作用。姚星星[14]的研究同样发现,动脉粥样斑块组织中Hes-1过表达可抑制VEGF诱导的血管生成。Choi等[15]研究发现,HES-1表达水平升高,骨桥蛋白水平降低,人类诱导多能干细胞向内皮细胞分化减少。

进一步研究HES-1对细胞凋亡及血管生成影响的潜在机制发现,HES-1过表达后Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信号通路受到抑制。PI3K/AKT信号通路与凋亡密切相关。徐梅玲等[16]研究表明,过表达LINC00189可通过激活PI3K/AKT信号通路抑制成骨细胞凋亡。Wnt信号通路不仅是发育生物学中的关键通路,也是血管生成的关键通路。胚胎干细胞分化为内皮细胞的过程是在Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信号通路的调控下进行的[17]。李清等[18]研究证明,miR-26a能靶向激活PI3K/AKT信号通路,上调血管生成相关因子,促进脑梗死大鼠血管内皮细胞增殖和血管生成。闫欢欢等[19]研究发现,miR-28-3p抑制剂可抑制PI3K/AKT信号通路,进而抑制视网膜中血管生成。Meng等[20]通过研究发现,鞣花酸通过抑制Wnt/β-catenin和PI3K/AKT途径抑制未分化甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果提示,敲除HES-1基因可促进Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信号通路激活,抑制凋亡并促进血管生成相关因子表达,表明Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信号通路是HES-1发挥作用的潜在通路之一。

综上所述,本研究首先建立了HES-1在Ea.hy926细胞中的过表达和敲除细胞模型,检测了细胞在胆固醇刺激下凋亡蛋白和血管生成因子的表达差异,进一步探索潜在机制,发现HES-1过表达可抑制Wnt/PI3K/AKT/β-catenin信号通路,促进细胞凋亡,抑制血管生成因子生成,而HES-1基因敲除后可缓解这种趋势,为治疗心血管疾病提供了新的思路,有待更多的动物及人体试验进行验证。