原发性肝癌组织中层粘连蛋白3、黏着斑激酶蛋白表达及其与患者临床病理特征和预后关系研究

刘立友,吴东洋,蔡青山,郑建兴,李树栋,刘 东

(唐山中心医院肝胆外科,河北 唐山 063000)

原发性肝癌可导致肝功能衰竭和病死率的升高,尽管肝癌的诊疗水平有了很大提高,但患者预后仍然较差,复发和转移率依旧很高。因此,研究肝癌的发病机制及寻找特异性标志物对肝癌患者的治疗和预后具有积极作用[1-2]。层粘连蛋白3(Laminin 3,LAMA3)在胰腺癌、鳞状细胞癌等肿瘤中表达上调,与肿瘤细胞的黏附和侵袭有关。有报道[3]显示,LAMA3的异常表达可参与肿瘤的发生和进展。黏着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)是一种非受体型酪氨酸激酶,在胃癌和结肠癌中异常高表达,可促进肿瘤新生血管的形成和肿瘤细胞的迁移与侵袭[4-5]。关于LAMA3、FAK与原发性肝癌关系的报道相对较少。因此,本研究探讨原发性肝癌组织中LAMA3、FAK表达情况及其与患者临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年11月至2020年2月于唐山中心医院接受肝癌切除术治疗的原发性肝癌患者75例,手术过程中采集癌组织和癌旁组织标本。其中,男性45例,女性30例;年龄34～78岁,平均(58.70±9.50)岁,年龄<60岁38例,≥60岁37例;TNM分期[6]中,Ⅰ-Ⅱ期42例,Ⅲ-Ⅳ期33例;肿瘤直径<5 cm者46例,≥5 cm者29例;甲胎蛋白(AFP)<400 U/ml者24例,≥400 U/ml者51例;乙肝表面抗原(HBsAg)阳性58例,HBsAg阴性17例;低、中分化40例,高分化35例;有淋巴结转移44例,无淋巴结转移31例;有血管侵犯32例,无血管侵犯43例。病例纳入标准:符合原发性肝癌诊断标准,经病理学确诊;首次确诊;纳入本研究前未接受其他治疗;签署知情同意书。排除标准:合并血液系统疾病或严重感染疾病;合并其他肿瘤或免疫系统疾病;有其他重要器官疾病史;精神异常者。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫组化法检测组织LAMA3、FAK蛋白表达:将癌组织和癌旁组织标本进行石蜡包埋并切片,经烤片、常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化和抗原热修复后,加入兔抗人LAMA3(1∶1500稀释)、FAK(1∶2000稀释)多克隆抗体(批号:ab217213、ab131435,英国Abcam公司),以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。4 ℃孵育过夜,PBS洗涤后加入二抗(批号:LF-2637,郑州微飒生物科技有限责任公司),37 ℃孵育30 min。二氨基联苯胺显色约2 min,苏木精复染,常规脱水,中性树胶封片。用已知LAMA3、FAK阳性切片作为阳性对照,显微镜下观察染色结果并拍照。

1.2.2 组织LAMA3、FAK蛋白检测结果判读:LAMA3、FAK蛋白主要定位于细胞质或细胞膜。①按阳性细胞数评分:阳性细胞比例≤5%计0分,5%<阳性细胞比例≤25%计1分,25%<阳性细胞比例≤50%计2分,50%<阳性细胞比例≤75%计3分,>75%计4分。②根据染色强度评分:无染色计0分,浅黄色计1分,棕黄色计2分,棕褐色计3分。将两项评分相乘得分0～1分为阴性,≥2分为阳性[7]。

1.2.3 随访:术后随访3年,每3个月复查1次。随访从术后第1天截止到2023年2月28日,记录患者生存情况,终点事件为死亡或到截止时间。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件分析数据。计数资料以[例(%)]表示,采用卡方检验;采用Kaplan-Meier生存曲线分析LAMA3、FAK蛋白表达与原发性肝癌患者预后的关系;采用Logistic回归分析原发性肝癌患者预后的影响因素;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝癌组织和癌旁组织LAMA3、FAK蛋白表达比较 见表1(图1)。肝癌组织LAMA3和FAK蛋白阳性表达率高于癌旁组织(均P<0.05)。

图1 原发性肝癌患者癌组织、癌旁组织LAMA3、FAK蛋白表达(免疫组织化学染色,×200)

2.2 肝癌组织LAMA3、FAK蛋白表达与患者临床病理特征的关系 见表2。有淋巴结转移和血管侵犯的患者肝癌组织LAMA3、FAK蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移和无血管侵犯的患者(均P<0.05)。

2.3 肝癌组织LAMA3、FAK蛋白表达与患者预后的关系 见图2。术后随访3年,生存患者35例,病死患者40例。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,肝癌组织LAMA3蛋白表达阳性患者3年累积生存率为36.00%(18/50),低于LAMA3蛋白表达阴性患者3年累积生存率68.00%(17/25)(χ2=6.857,P=0.009)。肝癌组织FAK蛋白表达阳性患者3年累积生存率为30.77%(12/39),低于FAK蛋白表达阴性患者3年累积生存率63.89%(23/36)(χ2=8.250,P=0.004)。

图2 肝癌组织LAMA3(左)、FAK(右)蛋白表达与患者预后的关系

2.4 肝癌患者预后影响因素Logistic回归分析 见表3。以肝癌患者术后3年内是否病死为因变量(是=1,否=0),将年龄(≥60岁=1,<60岁=0)、性别(男性=1,女性=0)、TNM分期(Ⅲ-Ⅳ期=1,Ⅰ-Ⅱ期=0)、肿瘤直径(≥5 cm=1,<5 cm=0)、AFP(≥400 U/ml=1,<400 U/ml=0)、HBsAg(阳性=1,阴性=0)、分化程度(低、中分化=1,高分化=0)、淋巴结转移(有=1,无=0)、血管侵犯(有=1,无=0)、LAMA3蛋白(阳性=1,阴性=0)、FAK蛋白(阳性=1,阴性=0)作为自变量进行Logistic回归分析。结果发现,有淋巴结转移、有血管侵犯、LAMA3蛋白阳性和FAK蛋白阳性是原发性肝癌患者术后3年预后的独立危险因素(均P<0.05)。

表3 影响肝癌患者预后的Logistic回归分析

3 讨 论

LAMA3基因位于人18号染色体,是层粘连蛋白α亚单位的编码基因,层粘连蛋白是由α、β和γ亚基组成的蛋白聚体,是构成基底膜的主要成分,可影响细胞行为和信号转导过程[8-9]。LAMA3的异常表达可影响层粘连蛋白的生物活性,与肿瘤的发生和发展密切相关[10]。研究[11]显示,LAMA3在胰腺癌组织中表达上调,且与患者的肿瘤大小、TNM分期显著相关。本研究结果显示,原发性肝癌患者癌组织LAMA3蛋白阳性表达率为66.67%,高于癌旁组织的28.00%,提示LAMA3与原发性肝癌的发生有关。进一步分析发现,有淋巴结转移和血管侵犯的患者肝癌组织中LAMA3蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移和血管侵犯的患者,提示LAMA3可能参与原发性肝癌的进展。LAMA3在肝癌中的作用机制可能与微小RNA的调控和甲基化有关。研究[12]显示,LAMA3在卵巢癌中高度甲基化,可导致患者化疗耐药,进而预后不良。Xu等[13]研究表明,靶向激活LAMA3可使得肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力增强,促进肺腺癌恶性进展。本研究推测LAMA3可能通过影响肝癌细胞的迁移与侵袭而参与肝癌的进展。

FAK是一种存在于细胞质的非受体酪氨酸激酶,与肿瘤细胞的黏附、增殖、迁移以及血管生长等多种生物学行为有关[14-16]。研究[17]发现,激活FAK表达可促进三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和糖代谢。本研究结果显示,原发性肝癌患者癌组织FAK蛋白阳性表达率为52.00%,显著高于癌旁组织的18.67%。有淋巴结转移和血管侵犯的患者肝癌组织中FAK蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移和血管侵犯的患者,提示FAK与原发性肝癌的发生和发展有关。本研究推测FAK在原发性肝癌中通过细胞黏附作用影响肝癌细胞迁移与侵袭,进而影响肝癌的进展。研究[18]显示,在人肝癌细胞中下调FAK表达可以抑制肝癌细胞黏附、迁移和侵袭能力。目前有关靶向FAK的抑制剂已有报道,如姚红兵等[19]研究表明,FAK抑制剂CT-707可减弱肝癌细胞侵袭、迁移能力,抑制肿瘤生长。

LAMA3、FAK表达还与癌症患者预后相关。王维杰等[20]研究表明,LAMA3高表达胰腺癌患者5年生存率显著低于LAMA3低表达患者,LAMA3是胰腺癌的不良预后因素。另有研究[21]显示,FAK的过表达及其磷酸化可显著缩短骨肉瘤患者总生存时间和无转移生存时间。本研究显示,肝癌组织中LAMA3、FAK蛋白表达阳性患者3年累积生存率显著低于LAMA3蛋白表达阴性患者,提示LAMA3、FAK可能通过影响肝癌细胞的迁移与侵袭而参与肝癌的进展,影响患者预后。本研究还发现,有淋巴结转移、有血管侵犯、LAMA3蛋白阳性和FAK蛋白阳性是原发性肝癌患者术后3年预后的独立危险因素,提示LAMA3、FAK蛋白可能能够作为预测原发性肝癌患者不良预后的标志物。在临床上,对较易复发和转移的患者进行LAMA3、FAK蛋白检测,对高表达患者密切关注和及早干预,可提高患者生存率。然而,LAMA3、FAK蛋白在原发性肝癌中的具体作用机制仍需进一步研究。

综上所述,原发性肝癌组织中LAMA3、FAK蛋白呈高表达,且两者阳性表达与患者淋巴结转移、血管侵犯及预后有关,可能作为原发性肝癌潜在的预后标志物。