高效液相色谱-串联质谱法测定牛乳中麦草畏残留

张立佳，刘丽君，白艳梅，汪 洋，莫 楠，高玉杰，李翠枝*

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

麦草畏属于苯氧羧酸类除草剂，价格低廉，除草效果显著，适用范围广，因此在农业生产中被大量使用，但是长期不规范使用该农药会对土壤和水体造成污染[1-2]。麦草畏在低剂量时显示出与植物生长素类相似的效果，但是在高浓度下会刺激分生细胞中的异常细胞生长[3-4]。人体摄入高剂量的麦草畏会导致血管组织阻塞，严重时可引起人类软组织的恶性肿瘤、干扰内分泌系统、肝肾损伤、迟发性神经病变等[5-6]。奶牛长期饲用残留麦草畏的饲料，会导致牛乳中蓄积该农药，对食品安全造成较大的风险隐患。GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[7]规定了生乳中麦草畏的临时限量为0.2 mg/kg。随着人们的生活水平不断提高，牛乳的需求量也日益增加，人们也更加关注麦草畏等农药残留带来的危害，因此构建牛乳中麦草畏快速、高效的检测方法迫在眉睫。

麦草畏的检测方法主要集中在谷物[8-12]、蔬菜[13-16]、烟草[17-18]等植物源基质，而牛乳中麦草畏的检测方法较少。但由于牛乳中含有大量蛋白质、脂肪、磷脂等成分，基质较复杂，已报道的植物源基质检测方法并不适合牛乳中麦草畏检测，同时植物源基质检测方法也存在诸多问题。由于麦草畏极性较强且不易汽化，气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）和GC检测时需要经过衍生化处理，过程复杂且耗时较长[8-11]；采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定时虽然不需要衍生化处理，且在常温下能够进行分离分析，但是灵敏度较低，且通常需采用液-液萃取、固相萃取等前处理技术再结合紫外检测器进行分析，所需试剂量较大，操作步骤繁多[15-16]；LC-MS/MS在LC的优势基础上，兼具串联质谱的高选择性、高灵敏度和准确性等诸多优点，已成为目前检测农药残留的主流方法[17-21]。本研究通过优化前处理方法和色谱条件，建立HPLC-MS/MS法测定牛乳中麦草畏的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳 市售；生鲜乳 呼和浩特地区牧场。

麦草畏标准品（纯度≥97.0%）、乙腈、甲酸（均为色谱纯）、0.22 μm聚四氟乙烯针式滤器 上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠（优级纯） 天津市富宇商贸有限公司。

1.2 仪器与设备

AB SCIEX 6500＋HPLC-MS/MS仪（配备电喷雾电离（elaectrospray ionization，ESI）源） 美国AB Sciex公司；ACQITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美国Waters公司；ST16R高速冷冻离心机美国Thermo Fisher公司；S25旋涡振荡器 德国IKA公司；TurboVap氮吹仪 瑞典Biotage公司；ME2002E分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Millipore Q纯水机美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

麦草畏储备液（500 μg/mL）：准确称取12.5 mg麦草畏标准品（精确至0.01 mg）于25 mL棕色容量瓶中，乙腈溶解并定容至刻度，0～4 ℃避光保存，有效期为3 个月。

标准中间溶液Ⅰ（10 μg/mL）：准确吸取1 mL储备溶液于50 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制质量浓度为10 μg/mL的标准中间溶液Ⅰ，0～4 ℃避光保存，有效期为1 个月。

标准中间溶液Ⅱ（1 μg/mL）：准确吸取1 mL标准中间溶液Ⅰ于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制质量浓度为1 μg/mL的标准中间溶液Ⅱ，现用现配。

1.3.2 样品前处理

称取2 g牛乳于30 mL离心管中，加入10 mL体积分数0.5%甲酸乙腈溶液，涡旋振荡提取10 min后，加入氯化钠2.0 g，再次涡旋振荡10 min，在4 ℃下以15 000 r/min离心10 min。准确移取5 mL上清液于12 mL玻璃氮吹管中，在40 ℃下氮气浓缩至近干，加入1 mL体积分数80%乙腈水溶液，涡旋复溶2 min，复溶液通过0.22 μm微孔滤膜过滤，用于仪器分析测定。

1.3.3 仪器条件

1.3.3.1 色谱条件

ACQITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流动相：A：0.01%甲酸溶液；B：乙腈；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution

1.3.3.2 质谱条件

ESI负离子模式（ESI-）；离子源电压：-4 500 V；离子源温度：450 ℃；气帘气（N2）压力：40 MPa；雾化气（N2）压力：50 MPa；辅助加热气（N2）压力：50 MPa；扫描方式：多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）。具体质谱参数见表2。

1.3.4 结果计算

试样中麦草畏的残留量按式（1）计算。

式中：X为试样中被测物残留量/（mg/kg）；ρ为试样上机溶液中被测物残留量/（ng/mL）；V为样液最终定容体积/mL；f为稀释倍数；m为试样质量/g；1 000为换算系数。

1.3.5 基质效应（matrix effect，ME）

选择阴性牛乳样品，按照1.3.2节方法处理后得到空白基质溶液。依次准确加入一定体积的标准品溶液，以空白基质溶液逐级稀释后得到质量浓度分别为5、10、20、50、100、250 ng/mL的系列标准工作溶液，现用现配。根据仪器响应和检测需要，浓度由低到高进行检测，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线。ME按式（2）计算。

1.4 数据处理

利用QTRAP 6500 HPLC-MS/MS Analyst工作站软件对谱图数据进行处理，Excel软件对实验数据进行统计分析，Origin 2022软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

对麦草畏标准品的质谱条件进行优化。首先，采用注射方式进样，对母离子进行扫描，获取目标物的母离子，然后通过子离子扫描获取其碎片离子，将母离子和2 个响应信号较强的碎片离子组成检测离子对，以MRM扫描方式优化去簇电压和碰撞能量。结果表明，在ESI-电离模式下，[M-H]-峰（m/z218.8）响应值较高，这是因为麦草畏苯环上有羧基，容易电离掉氢离子，同时苯环上含有氯原子，其同位素峰响应值也较高[22-24]。确定母离子后，分别对母离子m/z218.8和m/z220.9进行子离子扫描，确定特征碎片离子，响应值较高的碎片离子分别为m/z174.9（对应母离子为m/z218.8）和m/z176.9（对应母离子为m/z220.9），其他碎片响应值较小。因此，选取响应值较高的218.8/174.9和220.9/176.9作为定量定性监测离子对，完全满足欧盟2002/657/EC指令[25-26]。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 液相条件的选择

目前已报道的检测麦草畏的方法中，大部分流动相含有无机盐类，如甲酸铵和乙酸铵等[3,27]。由于无机盐不易挥发，对仪器和色谱柱污染较大，长期使用会降低仪器的灵敏度。因此，本方法以乙腈-水作为流动相体系，同时考察水中甲酸含量的变化（0、0.005%、0.010%、0.050%、0.100%）对麦草畏的仪器响应和色谱峰的影响。由图1可知：当水相不含甲酸时，色谱峰出现分叉，保留能力较差（图1A）；当水中加入0.005%甲酸时，麦草畏的峰形得到改善，但是存在拖尾等基质干扰（图1B）；当甲酸含量达到0.010%时，麦草畏的色谱峰最佳（图1C），继续增加甲酸的含量，峰形没有明显变化，但是响应逐渐降低（图1D、1E），因为麦草畏的电离模式为负离子模式，过高的甲酸含量会抑制麦草畏的离子化效率，导致响应降低。因此，最终选择0.010%甲酸溶液-乙腈为流动相。同时优化梯度洗脱的起始比例，进一步增强了麦草畏的响应，改善了目标化合物的分离效果。当流动相A、B的初始体积比为95∶5时，化合物的响应强度较高，能与相邻目标峰实现有效分离。

图1 麦草畏在不同甲酸比例流动相条件下的色谱图Fig.1 Chromatograms of dicamba with mobile phases containing different concentrations of formic acid

2.2.2 色谱柱的选择

考察麦草畏在Waters Anionic Polar Pesticide色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）、Phenomenex Kinetex Bphenyl色谱柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）和Waters ACQITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）上的色谱行为。结果表明，由于麦草畏极性较大，Waters Anionic Polar Pesticide色谱柱、Phenomenex Kinetex Bphenyl色谱柱对麦草畏具有一定的保留能力，但色谱峰峰形分叉、存在干扰峰、本底基线高、色谱峰拖尾、出峰时间不稳定等异常现象（图2A、2B），需要加入甲酸铵等盐类改善峰形，对色谱柱本身和仪器污染较大，严重影响灵敏度和使用寿命，不利于长时间进样分析。相比而言，麦草畏在Waters ACQITY UPLC BEH C18色谱柱上响应强度较高，出峰时间稳定（图2C）。因此，本方法最终选择Waters ACQITY UPLC BEH C18色谱柱进行分析检测。

图2 麦草畏在不同色谱柱条件下的色谱图Fig.2 Chromatograms of dicamba on different columns

2.3 前处理条件优化

2.3.1 提取体系的选择

由于麦草畏属于苯氧羧酸类除草剂，其酸度系数为1.9，在碱性条件下易离解成盐而溶于水相中，可在提取液中加入适量的甲酸来抑制麦草畏的离解，从而增强麦草畏向有机相中的分配比例。空白样品中添加麦草畏标准品后，分别经过0%、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%甲酸-乙腈溶液6 种体系提取，考察麦草畏的回收率，由图3可知：随着甲酸含量增加，麦草畏的回收率也逐渐增大，当乙腈中甲酸含量达到0.5%时，回收率达到最大值，这是因为酸化乙腈抑制了麦草畏中羧基被电离成离子，进而提高提取效率，回收率增大；继续增加甲酸的含量，麦草畏的回收率没有明显变化。考虑到麦草畏为负离子检测，过高的酸度会抑制化合物的响应，故选择0.5%甲酸-乙腈溶液作为提取体系。

图3 提取试剂中不同甲酸含量对麦草畏回收率的影响Fig.3 Effect of different formic acid contents in the extraction solvent on the recovery of dicamba

同时，考察前处理中加入不同含量的氯化钠对麦草畏回收率的影响，由图4可知：当不加氯化钠时，水相与有机相分层不明显，不利于上清液的移取；加入氯化钠后，两相分层明显，随着氯化钠含量的增加，麦草畏的回收率逐渐增大，当氯化钠含量达到2.0 g时，回收率最高达到99.2%，当氯化钠含量继续增加到2.5 g和3.0 g，回收率略有下降，因此氯化钠最佳使用量为2.0 g。最后，考察低温冷冻离心条件对样品的影响，当样品在4 ℃、15 000 r/min条件下低温高速离心10 min，使溶液中的脂肪凝结在液体表面，蛋白沉淀至液体底部，有效去除脂肪、蛋白等杂质，净化效果较好。

图4 氯化钠含量对麦草畏回收率的影响Fig.4 Effect of sodium chloride content on the recovery of dicamba

2.3.2 复溶溶剂的选择

为了减小溶剂效应对结果的影响，本研究考察不同体积分数的乙腈溶液（乙腈、水体积比：0∶100、5∶95、10∶90、20∶80、50∶50、80∶20、100∶0）作为复溶溶剂时麦草畏的回收率变化趋势，由图5可知：不同体积分数乙腈溶液对麦草畏回收率的影响显著，当选择水溶解样品时，麦草畏的回收率低于20%，随着乙腈体积分数的增加，麦草畏的回收率逐渐变大；当乙腈体积分数达到80%时，麦草畏的回收率达到95%以上；继续增加乙腈体积分数，麦草畏的回收率没有明显的变化，但是色谱峰出现峰展宽、峰分叉现象，这可能因为强溶剂溶解样品时，样品溶剂与流动相溶剂的强度相差较大，有些样品分子溶解在强溶剂中，并随强溶剂流过柱子，而有些则溶解在流动相中，从而导致峰分叉、峰展宽。因此，选择体积分数80%乙腈溶液作为复溶溶剂。

图5 不同复溶溶剂对麦草畏回收率的影响Fig.5 Effects of different redissolving solvents on the recovery of dicamba

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围、检出限和定量限

溶剂校准曲线的建立：依次吸取标准中间溶液Ⅱ（1 μg/mL）5、10、20、50、100、250 μL，经体积分数80%乙腈溶液稀释至1 000 μL，得到质量浓度分别为5、10、20、50、100、250 ng/mL的系列标准工作溶液。按质量浓度由低到高的顺序在最优色谱条件下测定，对峰面积（y）和质量浓度（x）进行线性拟合，建立标准曲线。由表3可知，相应的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）大于0.995，麦草畏在牛乳中的检出限均为5.0 µg/kg（信噪比≥3），定量限均为10.0 µg/kg（信噪比≥10），满足GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》对生乳中麦草畏的最大残留限量的规定。

表3 线性范围、相关系数（r）、检出限及定量限Table 3 Linear relationship, correlation coefficient (r), LOD and LOQ

2.4.2 ME

ME是除了目标物以外的其他物质，如蛋白、磷脂、脂肪、矿物质等对目标物的响应所产生的影响，导致目标物的响应增强或减弱，所产生的效应称之为基质增强或基质抑制[28-29]。ME为负值表示存在基质抑制效应，为正值表示基质增强，绝对值越大表示ME越强，需要通过基质匹配标准曲线减小ME对结果的影响[19]。结果表明，牛乳中麦草畏的ME为97.2%，ME不明显，可忽略不计，通过溶剂标准曲线进行外标法定量分析。

2.4.3 加标回收率和精密度

为了验证方法的准确性和重复性，对阴性牛乳样品分别进行低、中、高（10.0、20.0、200.0 µg/kg）3 个水平且每个水平重复6 次的加标回收实验。由表4可知，牛乳中麦草畏的平均加标回收率为96.2%～104.3%，相对标准偏差为1.5%～3.0%，说明该方法准确度和重复性较好，符合GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[30]对化学方法确认的规定，满足牛乳中麦草畏的检测要求。

表4 牛乳中麦草畏的加标回收率和精密度（n=6）Table 4 Recovery and precision of dicamba in spiked milk (n = 6)

2.5 实际样品测定

随机抽取呼和浩特地区市售生鲜乳30 批，参照本方法对样品进行检测，通过配制标准曲线、过程空白和加标回收进行质控，质控数据全部符合标准规定，30 批次均未检出麦草畏，说明样品不含有麦草畏。但由于采集样品量有限，并不反映麦草畏农残在牛乳中的整体污染情况，需要继续监测。

3 结 论

综上所述，本方法通过优化前处理方法和仪器条件，建立了检测牛乳中麦草畏的HPLC-MS/MS方法。提取试剂为0.5%酸化乙腈溶液，加入氯化钠含量为2 g，通过低温高速冷冻离心，采用体积分数80%乙腈溶液作为复溶溶剂，结合Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，以乙腈-体积分数0.01%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱分析。采用方法学验证结论，麦草畏的检出限和定量限分别为5.0、10.0 µg/kg，在牛乳中的平均回收率为96.2%～104.3%，相对标准偏差为1.5%～3.0%。本方法具有较高的灵敏度和准确性，操作简单，适合大批量样品的检测。