常见糖和糖醇对低分子可溶膳食纤维测试干扰研究

秦坤良

(通标标准技术服务有限公司广州分公司，广东 广州 510663)

膳食纤维包含两类，一部分是不溶性的植物细胞壁材料，主要成分为纤维素、木质素，另一部分是非淀粉水溶性多糖，如葡聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、抗性麦芽糊精和抗性淀粉等。它广泛存在于蔬菜、谷物、水果等植物源性食物中，根据其性质可以分为可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维。 它在人体中不能被消化，因此也不产生热量，一度被认为是“无营养物质”，但研究发现膳食纤维虽然不被消化，但是其仍然发挥着重要的生理作用，食用膳食纤维有助于降低胆固醇、血糖，改善肠道功能。目前膳食纤维越来越受到人们的重视，并被营养学界补充认定为是继蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质和水之后的“第七类营养素”[1-5]。

作为一种有益的功能性食品成分，随着人们重视以及食品工业发展，其应用也越来越广泛，目前市场上含有膳食纤维成分的功能性食品越来越多，迫切要求一种稳定可靠的检测方法用来保证产品质量。

目前膳食纤维的检测主要有酶重量法(GB5009.88-2014)和酶重量法-液相色谱法(GB/T22224-2008 第二法)来测定。酶重量法主要测定不溶性膳食纤维、可以被乙醇沉淀的可溶性高分子量膳食纤维，不能检测可溶性低分子量膳食纤维。酶重量法-液相色谱法则适合于测试低分子量的可溶性膳食纤维，如抗性麦芽糊精、低聚果糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖和抗性淀粉等物质[6]。

笔者在实践中发现对于配方比较简单的产品，采用GB/T22224-2008第二法酶重量法-液相色谱法测低分子量可溶性膳食纤维结果比较可靠，但对于配方复杂的产品则很容易出现干扰物质影响检测结果，如果不能排除干扰，检测结果和实际添加量误差就会很大，严重影响对产品质量的评估。

本文重点介绍GB/T22224-2008第二法酶重量法-液相色谱法检测可溶性膳食纤维中遇到的常见的糖和糖醇干扰和排除研究。

1 实 验

1.1 仪器和试剂

Agilent 1200系列液相色谱仪配有示差折光检测器；液相色谱柱：凝胶色谱柱6 μm，7.8 mm×300 mm TSK-GEL G2500PWXL 两根串联；分析天平：精密度0.1 mg AB204-S试验用水：一级水；玻璃柱：75 cm长，内径15 mm，下端1号砂芯，具聚四氟旋塞；碱性离子交换树脂(OH型)：Alfa Aesar，Amberlite IRA-67(在一级水中溶胀1周，用一 级水洗涤至滤液pH 7～8备用)；酸性离子交换树脂(Na型)：Amberlite 732，采用如下方法转化H型：取500 g树脂在一级水中溶胀1周，用一级水漂洗后加1200 mL一级水和400 mL 37%的盐酸，不时搅拌4 h，一级水漂洗后加2 L水浸泡2 h，重复一次，漂洗后至滤液pH 4～7备用。

1.2 标准品

抗性麦芽糊精(Resistant maltodextrin，RMD)，CAS.9050-36-6，Sigma；葡萄糖，CAS.50-99-7 纯 度>99.5%；丙三醇，CAS.56-81-5，纯度>99.5%。

1.3 试验过程

取试样两份平行测试，在α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶依次作用下将样品中淀粉、蛋白质等物质溶解为小分子状态，酶解液经乙醇沉淀、抽滤，用乙醇和丙酮洗涤残值，干燥称重后，减去由两份残渣测定得到的蛋白质和灰分质量，计算出不溶性膳食纤维(IDF)和在乙醇中沉淀的高分子量的可溶性膳食纤维(SDF)的总量(IDF+SDF)。抽滤液经脱盐，用高效液相色谱内标法测定洗脱液中低分子量可溶的膳食纤维，将两者相加，即可得到样品中总膳食纤维(TDF)。

1.4 低分子质量可溶性膳食纤维溶液的制备

样品酶解液经乙醇沉淀、抽滤，再用20 mL 78%乙醇洗涤残渣3次，10 mL 95%乙醇洗两次，10 mL丙酮洗两次。向滤液中加入10 mL 1%的丙三醇内标溶液，然后用78%乙醇定容500 mL。取200 mL 50 ℃下旋蒸近干，用一级水定容50 mL。

1.5 脱 盐

在玻璃柱中加入预先溶胀好并充分混合的10 g碱性离子交换树脂(OH型)和10 g转化为H型的酸性离子交换树脂，先用10 mL水洗涤，然后将上步50 mL溶液加到柱子中，用100 mL 水洗脱，流速0.8 mL/min收集150 mL溶液，50 ℃下旋蒸近干，加少量水转移出定容25 mL，过0.45 μm水相膜，待液相色谱分析。

2 结果和讨论

(1)对可溶性膳食纤维采用高效液相色谱示差折光检测法检测，通过凝胶色谱柱分子筛作用，将样品溶液中目标物按分子量大小进行分离，分子量由大到小先后出峰，其典型的色谱图如图1所示。

图1 浓度1%的RMD(抗性麦芽糊精)图谱Fig.1 RMD (resistantmaltodextrin)with 1% concentration

通过分析含量1%的抗性麦芽糊精标准品可以确认聚合度(Degree of Polymerization)DP≥3的可溶性膳食纤维保留时间。图1所示可溶性膳食纤维部分，其中DP-3峰为麦芽三糖，DP-2峰为麦芽糖，两者之间峰谷处为DP≥3的积分终点，左侧所有峰面积为可溶性膳食纤维。

在日常检测工作中，样品组成成分复杂，通过对比1% RMD标准品确定样品中可溶性膳食纤维积分终点的时候，经常会遇到干扰峰存在。积分终点存在干扰峰的典型图如图2所示。

样品与标准品RMD叠图确认，该样品的积分终点处存在一个峰起止跨二糖和三糖保留时间的干扰峰，按此种方式定量，会将一部分干扰峰峰面积计算为可溶性膳食纤维，计算含量是13%，远高于样品理论添加的抗性麦芽糊精的含量4%。

(2)干扰峰的确认：图2中样品配方发现除了添加抗性麦芽糊精外，还添加了大量的乳糖醇，乳糖醇的在此条件下的图谱如图3所示，和样品图谱对比，可以确定图2中干扰峰为乳糖醇，将图2中样品DP≥3的积分点前移至干扰峰起峰位置，将乳糖醇排除后计算结果为3.9%和理论值4%基本一致。

图3 乳糖醇出峰位置和RMD(抗性麦芽糊精)标准品叠加图可以看到在麦芽二糖(DP-2)和三糖(DP-3)之间；0.5%的麦芽糖醇、异麦芽酮糖醇和1% RMD叠图确认麦芽糖醇和异麦芽酮糖醇也会在DP-2和DP-3 之间出峰Fig.3 The peak position of lactitol and the superposition diagram of RMD (resistant maltodextrin)standard can be seen between maltobiose (DP-2)and trisaccharide (DP-3)； 0.5% maltitol，isomalt and 1% RMD overlay confirmed that maltitol and isomalt would also peak between DP-2 and DP-3

取乳糖醇标品配制成0.5%的溶液注入液相色谱，和1%的抗性麦芽糊精标品叠图如图3所示。

(3)考虑到现在产品中经常会添加各种糖醇、糖类物质，研究了常见糖醇、糖在同样条件的下图谱，发现双糖类物质如乳糖醇，乳糖、异麦芽糖、麦芽糖醇、异麦芽酮糖醇都会存在跨二糖和三糖积分点的情况出峰，都会对积分造成干扰，而单糖或分子量更小的糖醇比如山梨糖醇、赤藓糖醇、木糖醇、半乳糖醇则不会对积分造成干扰，这些物质和麦芽糊精标准图谱对比如图4～图6所示。

图4 0.5%乳糖和1%RMD叠图：乳糖会在DP-2和DP-3之间出峰Fig.4 Overlap of 0.5% lactose and 1% RMD： lactose peaks between DP-2 and DP-3

图5 0.5%蔗糖和1% RMD叠图：蔗糖在DP-2右侧出峰Fig.5 Overlap of 0.5% sucrose and 1% RMD：Sucrose peaks on the right side of DP-2

图6 山梨醇、木糖醇、半乳糖醇、赤藓糖醇出峰均在DP-2右侧Fig.6 The peaks of sorbitol，xylitol，galactitol and erythrose are all on the right side of DP-2

(4)对于配方中添加了会干扰膳食纤维测定的这些糖醇类物质，积分时将积分终点前移至干扰物峰起始位置积分，这样可以排除掉这部分干扰物质的影响，计算得到的可溶性膳食纤维结果会比较准确。

(5)除了采用积分方式排除干扰，对于含有乳糖的产品也可以用乳糖酶将乳糖酶解成单糖排除干扰，对含有异麦芽糖的产品则也可以用低聚-α-1，6-葡萄糖苷酶将异麦芽糖酶解成单糖排除干扰。但需要注意乳糖酶也可以酶解低聚半乳糖，低聚半乳糖是一种可溶性膳食纤维，如果配方中同时添加了低聚半乳糖，则无法采用乳糖酶酶解排除干扰[7]。

3 结 论

本文通过对GB/T22224-2008测定低分子量可溶性膳食纤维在实际检测中经常会遇到的糖和糖醇干扰性问题进行了研究和总结。GB/T22224-2008检测方法确定可溶性膳食纤维的积分终点主要是通过分析抗性麦芽糊精标准品，依据麦芽糖(DP=2)和麦芽三糖(DP=3)的位置确定终点，从方法检测的原理看对于聚合度大于等于3的低聚糖均计算为可溶性膳食纤维，因此对于实际样品的定量分析，首要是确定聚合度DP≥3的积分位置。

一部分二糖类物质可能由于空间结构和麦芽糖(DP=2)不同，此类物质在通过凝胶色谱柱中经过的路径和麦芽糖并不完全相同，致使这些物质出峰位置会落在麦芽糖和麦芽三糖之间，按照麦芽糖、麦芽三糖两个峰之间的峰谷确定的积分终点进行积分时，就会将这些物质的一部分计算为DP≥3的膳食纤维，导致膳食纤维结果比实际偏高。

通过对常见的糖和糖醇化合物保留时间的分析，可以确定乳糖、异麦芽糖、乳糖醇，麦芽糖醇、异麦芽酮糖醇会对可溶性膳食纤维的分析造成干扰。日常检测分析中排除这些添加物的干扰将可以提高膳食纤维测定的准确度，对于从事膳食纤维检测的分析工作者具有一定的参考意义。