日粮添加赖氨酸对瘤胃发酵特性和微生物菌群结构的影响

■ 龙唐晖 欧阳可寒 方艺恬 陈新锋 王成斌 李艳娇 欧阳克蕙 邱清华*

（1.江西省动物营养重点实验室，营养饲料开发工程研究中心，江西农业大学南方草地研究所，江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045；2.赣州绿林湾农牧有限公司，江西赣州 341103）

反刍动物瘤胃中栖息的大量微生物（细菌、原虫、真菌等）可将高纤维物质和非蛋白氮转化成自身维持和宿主生长发育所需的营养物质。作为瘤胃微生物中多样性最高的群体，瘤胃细菌在近些年被广泛研究和报道[1-3]。瘤胃微生物的多样性和群落结构受到宿主、日粮组成和环境条件等因素的影响[4]，其中日粮因素包括日粮营养水平、饲料原料类型和配比、饲料添加剂类型和剂量等。诸多研究发现，瘤胃微生物组成与反刍动物的生产效率高度相关[5-8]。因此，从瘤胃微生物多样性和群落组成的角度进行探讨，可以为日粮供给影响反刍动物生产性能提供机理层面的解释。

赖氨酸（lysine，Lys）是反刍动物的限制性氨基酸之一，其与蛋氨酸一同被认为是玉米型奶牛日粮中的第一限制性氨基酸[9]。国内外研究均发现，日粮中添加过瘤胃赖氨酸可以提高反刍动物的生产效率、改善动物产品质量[10-13]。这些研究将赖氨酸的促进作用靶点集中在后肠道的代谢吸收，考虑到日粮、瘤胃微生物和反刍动物表观生产性能三者之间的密切联系，是否可以通过改善瘤胃发酵环境为瘤胃微生物营造更好的生长繁殖条件，进而合成更多宿主需要的营养物质呢？已有研究发现，额外添加精氨酸和谷氨酸均能改善瘤胃发酵[14]。韦肖等[15]的体外试验也发现，添加0.10%和0.20%的赖氨酸可以提高瘤胃pH 和总挥发性脂肪酸的含量。然而，上述赖氨酸改善瘤胃发酵的结论是在体外条件下开展得出的，额外添加赖氨酸对瘤胃发酵改善效果如何、对瘤胃微生物是否有影响均需要进一步探究。为此，本试验基于体外试验筛选的最佳剂量，开展体内验证试验，探究赖氨酸对瘤胃发酵特性、微生物多样性和群落组成的影响，以期为赖氨酸促进瘤胃发酵的效果和机理研究提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

试验选用4 头健康、体重[（336.25±16.71）kg]和年龄[（6±0.32）岁]接近且安装永久瘤胃瘘管的锦江牛，随机分为2 组（对照组和试验组），每组2 头，采用有重复的2×2 拉丁方设计，对照组（C）饲喂基础日粮；试验组（L）饲喂基础日粮+0.20%的Lys。基础日粮组成及营养水平见表1。选用的Lys 为畜禽用Lys 盐酸盐（饲料级，98.5%），添加量根据韦肖等[15]的梯度试验确定。总试验期30 d，每期15 d，其中前10 d 为预试期，后5 d 为正试期。试验前2 个月所有试验牛均饲喂基础日粮，单栏饲养，提供充足饮水，饲养管理均由相同饲养员完成；试验期内除两组日粮不同外，其他饲养管理均一致。

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础）

1.2 样品采集

瘤胃内容物样品在正试期的第4天和第5天晨饲后2 h从瘤胃瘘管中采集。取出瘤胃内容物后立即采用便携式pH 计测定pH。将瘤胃内容物过四层纱布后得到瘤胃液，分装于5 mL 冻存管中，保存在-80 ℃冰箱中，用于后续瘤胃发酵参数和瘤胃微生物的检测。瘤胃发酵参数的检测和瘤胃微生物DNA 提取均在采样后1周内完成。

1.3 指标检测

瘤胃发酵参数包括pH、氨态氮（NH3-N）、微生物蛋白（MCP）、挥发性脂肪酸（VFA，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸）。其中瘤胃pH 在采样时现场测定，NH3-N 采用苯酚-次氯酸钠比色法[16]测定，MCP的浓度采用改良Lowry法[17]测定。VFA采用气相色谱仪基于相对保留时间确定单个挥发性脂肪酸种类，根据峰面积与标准曲线换算得出具体含量，仪器运行参数采用Qiu 等[18]建立的方法。支链挥发性脂肪酸为异丁酸、戊酸和异戊酸之和，某种挥发性脂肪酸占比为该种挥发性脂肪酸与总挥发性脂肪酸含量之比（%）。

将同一头牛每期2 d的瘤胃液样品均匀混合后进行DNA的提取，提取采用微生物DNA提取试剂盒。提取的DNA纯度用1%琼脂糖凝胶电泳评估，浓度用紫外分光光度计测定。采用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）对瘤胃细菌V3～V4 区域片段进行扩增，每个样品3 个重复。纯化后的PCR 产物送至北京奥维森基因科技有限公司采用Illumina Miseq PE300平台进行高通量双尾测序。原始下机数据在QIIME 2 平台完成，具体数据处理软件和参数设置与Wei等[19]相同。

1.4 数据统计

对于瘤胃发酵参数，先将每个个体牛每期连续2 d采集的瘤胃液数据求平均后作为该个体在对应时期的数值。所有数据均采用SPSS 软件中的一般线性模型，固定效应为处理、时期和个体。显著性定义为P＜0.05，趋势显著性规定为0.05≤P＜0.10。

2 结果与分析

2.1 日粮添加赖氨酸对瘤胃发酵特性的影响

由表2 可知，添加0.20%的赖氨酸可趋势性提高乙酸的含量（P=0.088），微生物蛋白、丙酸、总挥发性脂肪酸含量只在数值上较对照组高，但差异均不显著（P＞0.10）。

表2 日粮添加赖氨酸对瘤胃发酵特性的影响

2.2 日粮添加赖氨酸对瘤胃微生物多样性的影响

由表3 可知，日粮添加赖氨酸显著提高了瘤胃微生物的丰富度（Observed species,P=0.046），而对其他多样性指数均没有显著影响（P＞0.05）。

表3 日粮添加赖氨酸对瘤胃微生物多样性的影响

2.3 日粮添加赖氨酸对瘤胃微生物群落组成的影响

由表4 可知，添加赖氨酸在门水平上显著提高了髌骨细菌门（Patescibacteria）的相对丰度（P=0.010），并趋势性提高厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度（P=0.079），但对其他相对丰度高于0.1%的菌门均没有显著影响（P＞0.05）。

表4 日粮添加赖氨酸对瘤胃微生物门水平相对丰度的影响

由表5 可知，添加赖氨酸对瘤胃微生物属水平上相对丰度大于1%的物种均没有显著影响（P＞0.05）。

表5 日粮添加赖氨酸对瘤胃微生物属水平相对丰度的影响

2.4 瘤胃微生物多样性综合分析

相似性分析（ANOSIM）结果显示，对照组（C）和处理组（L）的P值为0.967，说明两组微生物差异不显著。通过主坐标分析（PCoA）也发现，C 组和L 组有明显的聚集（见图1），说明两组的微生物群落差异不明显。

图1 瘤胃微生物基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）

3 讨论

3.1 日粮添加赖氨酸对瘤胃发酵特性的影响

日粮添加赖氨酸并未改变瘤胃发酵参数和发酵模式。VFA 是反刍动物利用能量的主要形式，其含量与日粮组成、碳水化合物消化率、瘤胃微生物活性以及VFA 吸收率相关[20]。本试验对照组和处理组的日粮原料类型、组成比例及日粮营养成分并未发生改变，用于合成VFA 的碳水化合物量也相等，因此会得到VFA 总量、单种VFA 及VFA 占比均未出现显著差异。赖氨酸的添加可能通过提高部分瘤胃微生物的多样性促进乙酸的合成，但这种促进作用不足以引起显著差异，表现为趋势性的提高。MCP是反刍动物重要的氨基酸来源，其含量高低与碳水化合物类型、微生物组成和活性相关[21]。本试验发现，添加赖氨酸组的MCP 浓度只在数值上高于对照组，这可能是赖氨酸的添加对微生物活性提高不大，瘤胃微生物多样性的提高不足以促进MCP的合成。瘤胃pH是衡量瘤胃发酵环境的重要指标，过高或太低都会降低瘤胃微生物对底物的利用效率[22]。本试验发现，添加赖氨酸并未改变瘤胃pH，只在数值上略微低于对照组，这可以从数值上较高的总VFA 和较低的NH3-N 含量间接得到印证。

3.2 日粮添加赖氨酸对瘤胃微生物多样性和群落结构的影响

日粮添加赖氨酸提高了瘤胃微生物多样性，改变了部分瘤胃微生物的相对丰度。瘤胃微生物Observed species 是一个衡量微生物多样性中丰富度的指标，该指标数值越大，代表微生物多样性越高。添加赖氨酸提高了瘤胃微生物的Observed species，说明赖氨酸的添加可以提高瘤胃微生物的多样性，但其具体的促进机制仍需通过多组学联合分析来进一步揭示。髌骨细菌门（Patescibacteria）是地下水中常见的微生物门类，对不利环境有较强的适应能力[23]。添加赖氨酸提高了该门的相对丰度，暗示赖氨酸的添加可能会增强动物的抗逆能力。拟杆菌门和厚壁菌门是瘤胃微生物中相对丰度最高的两个门类，在本试验中分别占比66.34%和26.30%。添加赖氨酸均未显著影响这两个门类的相对丰度，只厚壁菌门的相对丰度趋势性高于对照组。出现厚壁菌门在赖氨酸添加组的相对丰度较高的原因与该组的瘤胃pH 较低有关，已有研究发现低瘤胃pH 环境中的厚壁菌门在瘤胃细菌中的占比较高[24]。

4 结论

① 日粮添加0.20%的Lys不影响瘤胃发酵特性。② 日粮添加0.20%的Lys 会改变瘤胃微生物多样性和部分菌门的相对丰度。