酵素源乳酸菌的益生功能及抑菌特性评价

肖仔君，钟瑞敏，陆伟东，康宇婷，林丽芳

（1.韶关学院英东食品学院，广东韶关 512005）（2.韶关学院化学与土木工程学院，广东韶关 512005）（3.韶关市紫背桃源生态科技有限公司，广东韶关 512000）

蔬菜水果酵素是以蔬菜、水果或药食同源草本类食材等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品。植物酵素产品由于其富含由多酚、酶、多糖多种维生素、氨基酸以及矿物质和微生物次生代谢产物等营养成分[1-6]，因此具有抗氧化、抗菌消炎、调节肠道菌群、增强机体免疫能力等多种功能[7-10]。随着人们对健康意识的增强，酵素类产品因其具有较高的食用、药用及营养价值而备受青睐。韶关地处粤北山区，属于亚热带季风气候，水果资源丰富，不同的季节都有特色水果，但由于水果采后储藏期短且易腐烂变质，因此对其进行深加工提高水果的附加值显得极其重要。因此以时令水果为原料开发新型酵素产品，不仅可以最大限度保留水果固有营养物质，还可增加新的活性成分，是集营养、保健、食疗等功能于一身的产品，具有广泛的市场前景。

研究表明，植物酵素发酵过程中主要是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌在起作用，基质中的各种微生物首先将多糖分解，然后在酵母菌作用下转化为乙醇，醋酸菌将乙醇转化为乙酸，基质中的糖浓度逐渐降低，并伴有蛋白酶、SOD酶等酶类的释放，因此酵母菌和醋酸菌在发酵过程中具有互利共生关系[11,12]。而乳酸菌在形成厌氧的条件下再进行发酵产生丰富的有机酸，改善酵素风味，为酵素提供更多功效起着重要的作用。

本研究从紫背桃源的酵素对乳酸菌进行分离纯化，得到12株乳酸菌，以这12株菌作为试验菌株，测定其自聚集性、耐酸性，以及对胆盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶与抗生素的耐受性进行测定，从而验证出菌株的益生性，为其进一步分离得到后酵素的商业应用提供理论依据，对扩大乳酸菌应用范围具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

乳酸菌：从紫背桃源酵素中分离，保存在实验室中。

指示菌：大肠杆菌（Escherichia coliGDMCC 1.115），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusGDMCC 1.2442），购于广东省微生物保藏中心。

1.1.2 培养基

MRS肉汤培养基和MRS琼脂培养基均购自广东环凯生物有限公司。

1.1.3 试剂

抗菌药物药敏纸片、牛胆盐等购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.4 仪器与设备

SM800酶标仪，上海永创医疗器械有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台，上海一恒科学仪器有限公司；MJX-250B-Z电热恒温培养箱，上海博讯实业有限公司；LC-LX-H185C台式高速离心机，上海力辰邦西仪器科技有限公司；MIKRO220R 752紫外可见分光光度计，上海光学仪器一厂；S1000 Thermal Cycler PCR仪，北京六一生物科技有限公司；DYY-6D电泳仪，北京六一生物科技有限公司；牛津杯；pH计等。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的活化

将保存在冰箱中从紫背桃源酵素在MRS固体培养基进行划线分离，37 ℃厌氧培养1～2 d。反复活化三次，直至性状稳定，放置4 ℃冰箱备用。

1.2.2 乳酸菌自聚集性的测定

根据参照文献[8]的方法微调整，将活化后的乳酸菌接种于灭菌MRS培养基中，37 ℃下培养24 h后取5 mL于离心管中，以6 000 r/min离心10 min收集菌体，加入5 mL灭菌后的PBS缓冲液，再以6 000 r/min离心2 min，重复2次洗涤乳酸菌，加入5 mL灭菌后的PBS缓冲液摇匀后于600 nm处测光密度值OD0值。以灭菌后的PBS缓冲液作为对照。

取4 mL菌悬液振荡10 s后静置。每隔1 h取0.1 mL上清液于3.9 mL灭菌后的PBS缓冲液中，振荡10 s后于600 nm处测吸光值OD值。依据下列公式进行计算每小时各自菌株的自聚集性结果，取平均值进行比较。

式中：

R——自聚集性，%；

OD0——乳酸菌样品实验测得的光密度值；

OD——菌悬液样品实验测得的光密度值。

1.2.3 乳酸菌酸耐受性研究

将活化后的乳酸菌接种于pH值2.5的MRS培养基中，放入37 ℃培养箱下孵育6 h，分别取孵育0、3、6 h孵育液稀释至合适梯度，进行活菌计数，计算其存活率。

1.2.4 乳酸菌的耐胆盐的研究

将活化后的乳酸菌接种于含有浓度为3 g/L牛胆盐的MRS培养基中，放入37 ℃培养箱孵育6 h。分别取孵育0、3、6 h的孵育液进行活菌计数。

1.2.5 乳酸菌的胃蛋白酶耐受性的研究

将活化后的乳酸菌接种于灭菌MRS培养基中，37 ℃下培养24 h。以10 mL灭菌后的pH值2.5的生理盐水为基础加入胃蛋白酶得到5 mg/mL的模拟胃液，加入活化后的乳酸菌菌液0.5 mL，摇匀37 ℃孵育6 h。取0、3、6 h孵育液测其活菌数，并计算其存活率。

1.2.6 乳酸菌的胰蛋白酶耐受性的研究

将活化后的乳酸菌接种于灭菌MRS培养基中，37 ℃下培养24 h。以10 mL灭菌后的生理盐水为基础加入胰蛋白酶得到10 mg/mL，调至pH值8.0的模拟肠液，加入活化后的乳酸菌菌液0.5 mL，摇匀37 ℃孵育6 h。3 h、6 h后取样后进行活菌计数，并计算其存活率。

1.2.7 乳酸菌的耐抗生素的研究

将活化后的乳酸菌接种于灭菌MRS培养基中，37 ℃下培养24 h。将0.1 mL待试乳酸菌菌株（1×108CFU/mL）均匀涂布于MRS琼脂培养基，待其凝固后将待试菌株徐布在MRS琼脂培养基，待其凝固后，将浸染抗生素的药敏纸片贴于平板上，于37 ℃培养48 h，观察并测量抑菌圈直径（mm）大小。采用一菌一药一判断值的原则，根据说明书敏感和耐药性的最小抑菌圈直径判定菌株的药敏性[8,13]。

1.2.8 乳酸菌对指示菌抑菌活性的测定

将已活化的Escherichia coliGDMCC 1.115和Staphylococcus aureusGDMCC 1.2442菌悬液加入到已灭菌并冷却至40～50 ℃的平板计数培养基中（使指示菌的浓度保持106CFU/mL），摇匀后迅速倒平板。待平板凝固后，在平板上均匀放置3个牛津杯，并在牛津杯中分别加入各株试验菌发酵液，加到牛津杯刚满为宜。37 ℃培养24 h，测定抑菌圈直径大小。

1.3 数据分析

所有实验重复3次，数据分析采用Graphpad进行统计和显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌自聚集性的测定

益生菌是否黏附到上皮细胞，与细胞表面的自聚集能力有关，自聚集能力确保益生菌在肠道中达到高细胞。酵素中的乳酸菌在通过人体消化道时，不仅要接受胃液的消化，还有胰液和胆汁的冲击，具有良好自聚集性的乳酸菌则不易被冲散，且容易聚拢，最终到达小肠时能有大部分乳酸菌存活并易黏附在肠道上进行增殖。

自聚集性标准[10]如下：自聚集性＞85%为高度聚集，自聚集性介于70%～80%为中度聚集，自聚集性＜70%为低聚集。如图1所示，试验中所有菌株的自聚集性均高于85%，均为高自聚集菌株。其中，xzj007菌的自聚集性最强，为93.22%；XZJ010菌的自聚集性最弱，为90.26%，这说明已筛选出来的菌株均具有较高的聚集性，有顺利通过上段消化道的可能性。这与李佳宇[8]的研究的乳酸菌自聚集性稍有不同，其试验菌株AS9、AS8、LX5的具有较好的自聚集性，分别为：88.55%、87.43%、85.55%。这说明受试乳杆菌具有潜在的对黏液和上皮细胞的黏附能力，这与文献对乳酸菌的聚集性研究结果相似[14,15]。

图1 乳酸菌自聚集性分析Fig.1 The self aggregation of the lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌耐酸性的研究

益生菌耐受胃环境中的低pH值和胃蛋白酶是其进入肠道发挥功能的关键步骤，胃表面的细胞主要分泌三种重要物质：粘液、盐酸和胃蛋白酶。因此，乳酸菌的耐酸性，是鉴定乳酸菌益生性的重要指标之一。受试的菌株在pH值2.5的MRS培养基培养4 h后，结果如图2所示，随着酸处理时间的延长，试验菌株对酸的耐受性均降低。菌株XZJ15在酸处理2 h与酸处理1 h相比，其OD600值下降速度较缓，仍保持较高的活率，随着处理时间的延长，OD600值仍接近1.0；而菌株XZJ07随着酸处理时间的延长，其OD600值下降明显，处理4 h后，其OD600值低于0.5，说明其对酸的耐受性较其他受试菌株差；所有的受试菌株经过酸处理后，仍存在一定的活性，但酸耐受性不同，说明这些菌株对酸的耐受较好，这源于这些菌株从酵素产品中分离出来的，它们对酸的耐受能力较强。这与现有从泡菜以及奶疙瘩分离出来的乳酸菌耐酸性研究基本一致[10]，这些都与受试的菌株从酸性产品中分离出相关。不同的益生菌对肠胃环境耐受能力不同，其中普遍乳酸杆菌属具有广泛的耐受性[16]，这一观点支持了本研究结果。

图2 乳酸菌耐酸性分析Fig.2 Acid resistance analysis of lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌耐胆盐的研究

乳酸菌能在人体中定植，其对胆盐的耐受性直接有较大的影响。乳酸菌对胆盐的耐受性，是鉴定乳酸菌益生性的重要指标之一。由图3可知，在胆盐浓度为0.3%的模拟人体胆汁环境中，酵素中筛选出了12株耐受性良好菌株的存活率呈下降趋势，但在测试过程中所有乳酸菌菌株均可存活。发现菌株XZJ05、XZJ06、XZJ09、XZJ10、XZJ12、XZJ14、XZJ18 7株菌对胆盐耐受性较强，在0.3%胆盐培养3 h后，活菌数仍达到106CFU/mL，尤其是在的菌株XZJ6、XZJ18在高浓度胆盐环境中培养6 h后，活菌数达到106CFU/mL，明显高于菌株XZJ007对胆盐的耐受性，表现出在含0.3%胆盐培养环境中具有良好的生长特性，说明这6株菌具有较好的胆盐耐受性，能够在较高的胆盐浓度下存活下来。而菌株XZJ15在含0.3%胆盐环境中，在处理3 h后，其活菌数仍达到106CFU/mL，但随着处理时间延长，其对胆盐的耐受性急剧下降，处理5 h后，其活菌数又下降了2个数量级，说明菌株XZJ15在含0.3%胆盐环境中处理时间超过5 h后其耐受性较差，这可能是由于高浓度胆盐容易改变细胞膜通透性并离解膜内蛋白质，从而使得细胞内的物质流出，导致细胞死亡。

图3 乳酸菌耐胆盐分析Fig.3 Analysis of bile salt tolerance of lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌的胃蛋白酶耐受性测定

乳酸菌对人体的益生性除了要耐受胆盐，还需耐受胃蛋白酶，才能顺利通过胃到达小肠，因此，乳酸菌对胃蛋白酶的耐受性，是鉴定乳酸菌益生性的重要指标之一。人工胃液pH值通常在3.0左右，因此选择在pH值2.5且胃蛋白酶质量浓度为5 mg/mL的模拟胃液中进行乳酸菌的耐受性实验。由图4可知，乳酸菌存活率呈下降趋势，但在测试过程中所有乳酸菌菌株均可存活。其中，在人工模拟的胃液孵育4 h后，12株菌株均可生长，但耐受性不同，菌株XZJ07存活率为19%，说明其耐受人工胃液的能力较差；其余11株存活率存活率均大于40%，说明乳酸菌抗人工胃液的能力因菌株的不同而有显著的差异。菌株XZJ15、XZJ18存活率最高，人工胃液处理4 h后，其存活率高达50%以上。考虑食物在胃液中停留时间大致为1～2 h，孵育2 h后的12株乳酸菌其存活率均大于75%，由此看见，受试的12株菌对人工胃液有一定的耐受力。

图4 乳酸菌对胃蛋白酶耐受性分析Fig.4 Analysis of pepsin tolerance of lactic acid bacteria

2.5 乳酸菌的胰蛋白酶耐受性测定

胰液中会分泌胰蛋白酶进入肠液，肠液呈微碱性，对乳酸菌有胁迫作用。所以除了胃酸和胆盐外，乳酸菌对胰蛋白酶的耐受性，也是鉴定乳酸菌益生性的重要指标之一。如图5所示，在胰蛋白酶质量浓度为10 mg/mL的模拟肠液中，受试12株菌株在人工肠液中均可生长，且呈现不同的差异性。在孵育3 h后，12株受试菌株仍保留80%的存活率，随着孵育处理时间延长，乳酸菌存活率呈下降趋势，仍保持有50%的存活率（XZJ07耐受胰蛋白酶能力差，处理6 h后，其存活率只有20%），但在测试过程中所有乳酸菌菌株均可存活。这与张悦等[17]研究乳酸菌在人工肠液中报道的基本一致。

图5 乳酸菌对胰蛋白酶耐受性分析Fig.5 Analysis of trypsin tolerance of lactic acid bacteria

2.6 乳酸菌的耐抗生素测定

药敏试验是目前国际上作为益生菌耐药性评价方法，也是判定是鉴定乳酸菌益生性的重要指标之一[18]。许多研究表明，乳酸菌对各种抗生素的敏感性因物种而异，且不同物种之间的敏感性相差可达数倍。根据抗菌药物敏感试验标准，本研究对受试菌株的抗生素敏感性进行了分析，由表1可知，受试12株菌株对土霉素、红霉素、四环素具有较高的耐药性，其抑菌圈的直径为0 mm，对氨苄西林的耐药性敏感，这可能是由于在这些酵素各组分在种植过程中，乳酸菌被抗生素治疗的人和动物所携带的抗药性菌株所污染所致。

表1 12株乳酸菌菌株对不同抗生素的抑菌圈直径（mm）和敏感度Table 1 The sensitivity and diameter of inhibition zone of 12 strains LAB to different antibiotics

2.7 乳酸菌对指示菌抑菌活性的测定

乳酸菌发酵过程中能产生有机酸、抗菌肽等物质，对肠道有害菌有拮抗作用，抑制它们的增殖。因此，研究受试菌株对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌指示菌的抑制作用。图6结果表明受试12株菌株均对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制效果，除了XZJ07对大肠杆菌的抑菌效果稍弱一点外，其他菌株抑菌直径大于15.00 mm，而受试12株菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到20.00 mm，这与文献报道的研究结果一致[8]。

图6 乳酸菌对指示菌的抑制作用Fig.6 The inhibitory effect of lactic acid bacteria on indicator bacteria

3 结论

将从紫背桃源酵素中分离的12株乳酸菌对其自聚集性、酸耐受性试验以及在模拟的人工胃液人工肠液对胃蛋白酶、胰蛋白酶的耐受性试验中，所选用的12株乳酸菌均为高聚集的菌株。在乳酸菌的耐酸性测定中，除了XZJ07对酸的耐受性较差，其他11株均具有较强的耐受性。除了XZJ07以外，其他11株菌株在pH值为2.5的模拟胃液中培养2 h存活率仍达75%以上；在0.3%胆盐中培养3 h后，受试菌株的活菌数仍可达106CFU/mL；受试菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有一定的抑制作用，除了XZJ07对大肠杆菌抑菌圈直径12 mm外，其他11株菌株的抑菌圈直径均超过15.00 mm，且受试菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，其抑菌圈直径约20.00 mm；受试菌株对氨苄青霉素敏感，对四环素、红霉素、土霉素较为耐受。综上所述，分离得到的乳酸菌在体外试验中表现出潜在益生性为其在益生性发酵剂及其在相关领域的应用提供了理论依据。