大蒜素调控中性粒细胞功能抗白色念珠菌感染的作用机制研究

蔡元圆,徐璐,钱峰

(上海交通大学药学院,上海 201100)

白色念珠菌(Candidaalbicans,简称C.albicans)是真菌谱系中最常见、致病性最强的机会性真菌。从轻微的念珠菌血症到系统爆发性的脓毒血症,侵袭性白色念珠菌感染导致的临床死亡率超过70%[1-2]。尽管真菌感染对人类健康构成极大威胁,但临床治疗药物的有限性、药物毒副作用的普遍性以及耐药菌株突变的高发性极大阻碍了疾病的临床治疗[3-4]。

固有免疫系统是机体抵抗真菌感染的重要防线,在真菌感染初期可通过免疫细胞的吞噬与杀菌作用抵抗病原菌入侵。中性粒细胞作为固有免疫系统中一类经典的吞噬细胞,在白色念珠菌清除过程中发挥关键作用。中性粒细胞可通过其细胞膜表面的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),如C型凝集素受体(CLRs):Dectin-1、 Dectin-2,以及Toll样受体(TLRs):TLR 2、 TRL 4等,特异性地识别真菌病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),包括细胞壁表面的β-葡聚糖、甘露聚糖、几丁质等,触发免疫应答[5-7]。激活的中性粒细胞会释放一系列细胞因子,如IL-6、IL-8、IL-17、IFN-γ等,进一步招募循环的中性粒细胞至感染部位以发挥杀菌作用[8]。中性粒细胞杀灭真菌的机制主要包括两方面:一、招募至感染位点的中性粒细胞会通过释放大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)制造“活性氧风暴”,以ROS的强氧化性和破坏性直接杀死真菌;二、中性粒细胞可形成中性粒细胞细胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)捕获真菌,抑制其扩散和繁殖,并释放抗菌肽、过氧化氢酶等杀菌分子破坏真菌细胞壁和细胞膜,从而导致真菌死亡[9]。

大蒜素是葱属植物大蒜(AlliumsativumL.)中提取出的有机含硫化合物,具有广泛的抗真菌活性。已有研究报道,大蒜素可选择性地抑制真菌中含硫蛋白质的合成及真菌细胞壁的形成或直接破坏真菌的生物膜结构而发挥杀菌作用[10-11],然而真菌感染中,大蒜素对免疫系统的调控研究较少。因此,探究大蒜素对免疫细胞的功能调控并阐明相关的分子机制,对于明确大蒜素的抗菌分子效应并开发更有效的抗菌药物靶点具有重要的指导意义。

本研究证明了大蒜素能促进中性粒细胞释放ROS对抗白色念珠菌的感染,并证明中性粒细胞ROS释放量的增加与MAPK信号通路中p38 MAPK磷酸化的增强相关。本研究结果表明,大蒜素可能成为临床治疗真菌感染的有效候选化合物。

1 材料与方法

1.1 试剂

大蒜素(Allicin,CAS:CAS:539-86-6)购自德尔塔生物;辣根过氧化物酶(HRP)和二甲基亚砜(DMSO)购自德国Sigma-Aldrich;异鲁米诺(Isoluminol,3682-12-2)购自美国TCI;磷酸酶抑制剂Cocktial I(HY-K0022)和佛波酯(PMA,HY-18739)购自中国MCE;Percoll和OptiprepTM购自挪威Axis-shield;BactoTMTryptone胰蛋白胨(211705)和酵母提取物购自美国BD Bioscience;RPMI-1640培养基,青霉素-链霉素双抗(100 ×),蛋白marker购自德国Thermo Fisher;胎牛血清购自中国dCell Technology;特超敏化学发光底物ECL,过碘酸-雪夫(PAS)染色试剂盒及4%多聚甲醛购自中国碧云天;红细胞裂解液购自中国生工;β-actin(#3700),Phospho-p38 MAPK(#4511),p38 MAPK(#8690),Phospho- ERK1/2(#4370),ERK1/2(#9102),Phospho-SAPK/JNK(#4668)及SAPK/JNK(#9252)抗体购自美国Cell Signaling Technology;HRP连接的二抗(兔抗,鼠抗)购自美国Jackson ImmunoResearch;硝酸纤维素印记NC膜(0.45 μm)购自德国GE Healthcare Life Science。

本实验所用小鼠均为6～8周龄,体重20～25 g的SPF级别野生型BALB/c雌鼠,购自上海杰思捷实验动物有限公司,饲养于上海交通大学实验动物中心,饲养条件为:恒定湿度55%,恒定温度25 ℃,光照循环为12 h,饮食饮水自由提供。所有动物实验操作均严格遵循上海交通大学生物学研究伦理委员会及国立卫生研究院的相关规定。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠骨髓中性粒细胞(PMNs)分离

取6～8周的野生型BALB/c小鼠,处死后分离小鼠股骨及胫骨,在无菌环境内将骨髓细胞冲出并收集,离心(1 000 r·min-1,3 min)后弃上清,用灭菌PBS重悬细胞。准备一支15 mL离心管,加入3 mL的1.080 g·mL-1OptiPrepTM稀释液(按照说明书配置,含14% Iodixanol);随后用巴氏吸管吸取3 mL的72% percoll至底部缓慢加入,此时可见明显的液体分层;最后在上层加入骨髓细胞悬液,需注意避免破坏液体分层。离心(2 000 g,20 min)后,吸取位于percoll和OptiPrepTM稀释液间的液体,并转移至新的15 mL离心管,加入过量PBS后离心(1 000 r·min-1,5 min)弃上清,PBS再次重悬洗涤细胞后,加入1 mL红细胞裂解液重悬细胞沉淀,冰上静置3 min后,加入过量PBS终止裂解并离心(1 000 r·min-1,5 min),最后使用RPMI 1640完全培养基(含10% FBS和青霉素-链霉素双抗)重悬细胞并在37 ℃含5% CO2的培养箱中培养。

1.2.2 白色念珠菌的活化与灭活

白色念珠菌的活化:白色念珠菌标准菌株(SC5314)馈赠自第二军医大学药学系姜远英课题组,冻存于-80 ℃超低温冰箱。冻存的白色念珠菌划线接种于SDA平板上,30 ℃培养48 h,挑取单菌落并用1 mL YPD培养基重悬,于恒温摇床(30 ℃,220 r·min-1)内培养至菌株的对数生长期(16～18 h),重复摇菌两次,即完成菌株的活化。

白色念珠菌的灭活:从SDA平板上挑取单克隆菌株并用1 mL YPD培养基重悬,于恒温摇床(30 ℃,220 r·min-1)中培养至对数生长期(16～18 h),经灭菌PBS洗涤两次后,于99 ℃水浴锅中静置30 min,即完成菌株的灭活。

1.2.3 小鼠白色念珠菌系统性感染模型建立

使用方法1.2.2活化白色念珠菌后,用灭菌PBS洗涤三遍并调整菌液浓度为2.5×106CFU·mL-1备用。挑选6～8周的雌性BALB/c小鼠,经尾静脉注射200 μL上述白色念珠菌悬液,造模当天记为第0天,感染24 h后以腹腔注射的方式同时间点连续给药3天,于第四天取材。以氟康唑治疗组(fluconazole,FKZ)作为阳性对照组,溶剂对照组小鼠在造模后的1～3 d腹腔注射200 μL 2% DMSO + 98% PBS溶液。大蒜素与氟康唑均使用DMSO溶解并用PBS稀释至指定浓度。

1.2.4 肾脏载菌量检测

小鼠脱颈处死后于75%乙醇中浸泡10 min,随后在超净台内取出小鼠肾脏,一侧肾脏组织称重后放入含有1 mL灭菌PBS和研磨磁珠的厚壁离心管中,组织研磨仪匀浆后,用灭菌PBS梯度稀释组织匀浆液为10 ×、100 ×、1 000 ×,稀释液各取100 μL涂布于SDA平板,30 ℃培养48 h后对菌落计数。计算每只小鼠肾脏匀浆液的Log10(CFU/g)值,用GraphPad Prism 9.0软件作图并分析。

1.2.5 超氧化物(Superoxide)检测

使用Hank’s平衡盐溶液(含0.05%牛血清白蛋白)重悬分离得到的小鼠原代PMNs,并调整细胞密度至5×105个·mL-1,白色不透明96孔板每孔加入200 μL PMNs细胞悬液,不同浓度大蒜素孵育细胞后,每孔加入100 μmol·L-1Isoluminol和40 U·mL-1HRP,37 ℃培养箱中避光孵育5 min后,在37 ℃条件下连续读取化学发光值5 min。随后加入灭活的白色念珠菌(MOI=10)刺激,PMA(200 ng·mL-1)或灭菌PBS溶液分别作为阳性或阴性对照,37 ℃条件下继续读取化学发光值1 h。用GraphPad Prism 9.0软件作图并分析,比较曲线下面积。

1.2.6 体外杀菌能力检测

分离小鼠原代PMNs细胞,并以8×104个·孔-1的密度接种于48孔板培养过夜。细胞贴壁后,更换培养基为新鲜的无血清RPMI 1640培养基,加入不同浓度大蒜素孵育细胞30 min后取出孔板,加入活的白色念珠菌悬液(MOI=10),37 ℃培养2 h后,收集各孔上清液到对应离心管,随后向各孔内加入200 μL 10% Triton X-100裂解细胞,合并上清液与细胞裂解液后,梯度稀释500倍,各取100 μL稀释液涂布于SDA平板,相同实验操作处理等量活菌菌液作为无细胞对照组,SDA平板于30 ℃培养箱内培养48 h后,菌落计数并计算细胞杀菌百分比。

细胞杀菌百分比=(无细胞对照组菌落数 - 实验组菌落数)÷ 无细胞对照组菌落数 × 100%。

1.2.7 组织切片染色

小鼠肾脏组织用4%多聚甲醛固定48 h后,放入不同浓度的乙醇溶液中逐级脱水(80% → 95% I → 95% II → 100% I → 100% II,各1 h),随后放入二甲苯溶液中逐级透明(二甲苯 I → 二甲苯 II,各30 min),浸蜡3 h后即可进行石蜡包埋。包埋的蜡块切片(厚度为5 μm)后,在70 ℃烘箱中烘烤45 min,随后浸入二甲苯溶液中逐级脱蜡(二甲苯 I → 二甲苯 II,各20 min),并在梯度乙醇溶液中脱水(100% → 95% → 90% → 80% → 70%,各10 min),即可进行PAS染色。按照试剂盒说明书依次进行氧化、染色、苏木精复染、酚化、返蓝、乙醇逐级脱水、二甲苯透明后,中性树胶封片并晾干,随后即可用于正置显微镜下观察与拍照记录。

1.2.8 免疫印迹实验

小鼠PMNs细胞以1×106个·孔-1的密度接种至6孔板,培养过夜后,进行细胞的处理与刺激,弃去培养基后,每孔加入120 μL 1×loading buffer(含β-巯基乙醇),并用细胞刮刀充分裂解细胞,99 ℃金属浴中煮样10 min,待样品冷却至室温即可用于免疫印迹实验的检测。

根据SDS-PAGE胶的配置方法准备分离胶和浓缩胶;向电泳槽内侧加满1×running buffer,细胞裂解液样品混合均匀后,取等量裂解液加入胶孔中,多余孔用等量1×loading buffer补齐,随后在电泳槽外侧补满1×running buffer;电泳装置设置电压为80 V,电泳时间为30 min,待样品跑过浓缩胶,将电压调整为120 V继续跑胶至条带到达胶板底部;根据“海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵”夹心法组装转膜装置后,调节电压至110 V,根据目的蛋白分子大小调整转膜时间,转膜全程在冰水浴中完成;转膜结束,将NC膜取出浸泡在5%牛奶中,室温封闭1～2 h;用1×TNET buffer洗去残留牛奶,4 ℃下孵育一抗14 h,洗膜(1×TNET buffer,5 min每次,共3次),室温孵育二抗2 h,洗膜(1×TNET buffer,5 min每次,共3次);将NC膜正面朝上放置,滴加ECL显影液,使用Bio-Rad成像仪进行条带成像,完成免疫印迹检测。

1.2.9 统计学分析

本研究中,实验数据均在至少3次独立重复实验基础上统计,数值以平均值±标准误(mean ± SEM)来表示,用GraphPad Prism 9.0软件完成数据的处理、作图与分析,两组间比较采用非配对样本t检验,组间均数比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析,进一步两两比较采用Tukey检验。当*P<0.05时认为结果具有统计学意义。

2 结果

2.1 大蒜素具有抗白色念珠菌系统性感染的作用

大蒜素是提取自葱属植物的一种天然化合物,其化学结构如图1A所示。为了评估大蒜素在白色念珠菌感染中的抗菌效果,我们建立了白色念珠菌系统性感染模型,如图1B所示。肾脏是白色念珠菌感染的主要靶器官,因此我们检测了对照组与实验组小鼠的肾脏真菌载量,并通过肾脏切片观察了真菌富集情况。如图1C所示,与模型组相比,大蒜素治疗组的小鼠其肾脏的真菌载量明显降低。PAS染色结果显示,模型组小鼠的肾脏中有大量的白色念珠菌积累,且多数以细长菌丝态存在,而大蒜素治疗后,小鼠肾脏组织的真菌载量明显减少,同时真菌主要以短棒状及圆形的孢子态存在(图1D)。因此,以上结果表明大蒜素具有抗白色念珠菌系统性感染的作用。

A:大蒜素(Allicin)化学结构式(MW:162.27);B:白色念珠菌系统性感染模型构建方案;C:肾脏组织载菌量检测;D:肾脏组织PAS染色结果。与模型组比较,***P < 0.001,**** P < 0.000 1。CA:白色念珠菌;FKZ:氟康唑。红色箭头指向白色念珠菌形态。图1 大蒜素具有抗白色念珠菌系统性感染的作用

2.2 大蒜素增强中性粒细胞的杀菌作用

中性粒细胞是一类经典的吞噬细胞,在真菌感染中通过吞噬作用、ROS的释放以及NETs的形成杀灭真菌。

为了研究大蒜素是否对中性粒细胞的功能具有调控作用,我们通过体外杀菌检测实验探究了大蒜素对中性粒细胞杀菌能力的影响。实验结果表明,与未处理组相比,大蒜素孵育中性粒细胞能显著增强其杀菌作用,并且杀菌效果随大蒜素浓度的增加而显著增强(图2A,图2B)。

2.3 大蒜素促进中性粒细胞产生ROS

为了探究大蒜素对中性粒细胞杀菌作用的调控机制,本研究使用热灭活的白色念珠菌(HKCA)刺激中性粒细胞,并检测ROS的产生。实验结果表明,大蒜素剂量依赖性地促进了中性粒细胞产生超氧化物,并且在300 nmol·L-1浓度下,大蒜素的促进效果最明显,与未处理组相比,中性粒细胞释放的超氧化物增加了3倍以上。因此,这些结果表明大蒜素通过促进ROS的释放来增强中性粒细胞的杀菌作用(图3A,图3B)。

A:Isoluminol-HRP系统检测PMNs中超氧化物的产生;B:超氧化物的定量统计。与DMSO+HKCA刺激组相比,*P < 0.05,**P<0.01。HKCA:热灭活的白色念珠菌。图3 大蒜素促进中性粒细胞产生ROS

2.4 大蒜素增强MAPK信号通路的激活

在真菌感染过程中,MAPK信号通路的激活能增强中性粒细胞的吞噬作用及清除真菌的能力[12]。因此,本研究检测了300 nmol·L-1大蒜素在不同时间点(0、5、15、30、60 min)对MAPK信号通路激活的影响(图4A)。实验结果表明,在灭活的白色念珠菌刺激下,中性粒细胞中p38 MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平明显升高,而大蒜素孵育中性粒细胞后进一步增强了相关蛋白的磷酸化水平,并且与未处理组相比,大蒜素孵育组中ERK1/2和JNK的磷酸化水平在白色念珠菌刺激5 min后就出现显著性差异(图4B～图4D)。

A:300 nmol·L-1大蒜素孵育PMNs 0.5 h,HKCA(MOI=10)刺激不同时间后,western blot检测p38 MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平;B-D:灰度统计分析结果。与未处理组同一时间点比较,*P < 0.05,**P<0.01。HKCA:热灭活的白色念珠菌。图4 大蒜素时间依赖性地增强MAPK信号通路的激活

随后我们使用不同浓度的大蒜素孵育中性粒细胞,并检测灭活的白色念珠菌刺激15 min后相关蛋白的磷酸化水平(图5A)。结果显示,随着大蒜素剂量的升高,MAPK信号通路中相关蛋白的磷酸化逐渐增强,说明大蒜素以剂量依赖性的方式调控中性粒细胞中MAPK信号通路的激活(图5B～图5D)。

A:不同浓度大蒜素孵育PMNs 0.5 h,HKCA(MOI=10)刺激15 min后,western blot检测p38 MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平;B-D:灰度统计分析结果。与对照组比较,*P < 0.05。HKCA:热灭活的白色念珠菌。图5 大蒜素剂量依赖性地增强MAPK信号通路的激活

2.5 大蒜素促进中性粒细胞释放ROS依赖于p38 MAPK的激活

本研究使用p38 MAPK抑制剂(SB203580)探究其对中性粒细胞ROS释放的影响,结果显示,SB203580有效地抑制了大蒜素诱导的中性粒细胞中活性氧的产生(图6A)。此外,western blot结果表明,p38 MAPK抑制剂特异性地抑制了p38 MAPK的磷酸化,而不影响ERK1/2和JNK的激活(图6B～图6E)。因此,这些数据表明,大蒜素可能通过增强p38 MAPK的激活促进了ROS的产生。

A:10 mmol·L-1 SB203580孵育PMNs 1 h,随后加入300 nmol·L-1大蒜素孵育PMNs 0.5 h,加入HKCA(MOI=10)后通过Isoluminol-HRP系统检测HKCA刺激1 h内PMNs中超氧化物的产生;B:10 mmol·L-1 SB203580孵育PMNs 1 h后,使用300 nmol·L-1大蒜素孵育PMNs 0.5 h,随后HKCA(MOI=10)刺激15 min后,western blot检测p38MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平;C-E:灰度统计分析结果。与指定组相比,*P < 0.05,NS:无显著性差异。HKCA:热灭活的白色念珠菌。图6 大蒜素促进中性粒细胞释放ROS依赖于p38 MAPK的激活

3 讨论

白色念珠菌感染是造成免疫功能低下人群高死亡率的原因[13],作为最常见的真菌病原体之一,白色念珠菌的致病机制和宿主防御机制已得到广泛研究。其中,白色念珠菌的生物膜结构是造成宿主感染及真菌耐药的主要原因,生物膜的形成一方面可使真菌处于低代谢状态而降低其对药物的敏感性,另一方面可以限制抗菌药物的渗透,从而将真菌对药物的抗性提高10～1 000倍,并最终导致超级耐药菌的产生[1,14]。当出现耐药真菌感染时,选择有效的抗菌药物变得更为困难,因此增强宿主的免疫防御机制及真菌清除能力是对抗真菌感染更有效的策略。

大蒜素在多类真菌感染中表现出显著的抗菌活性:在新生隐球菌感染中,大蒜素可降低真菌细胞膜的通透性导致真菌涨裂死亡,从而发挥抗真菌作用[15];此外,大蒜素还可以破坏酵母菌细胞膜电化学势平衡,诱导酵母细胞凋亡[16];大蒜素抗白色念珠菌感染的研究也揭示了大蒜素能够抑制白色念珠菌生物膜的形成并破坏其生物膜结构[17]。同样的,本研究通过系统性白色念珠菌感染模型验证了大蒜素的抗真菌活性。此外,白色念珠菌作为双态性真菌,可通过酵母菌型态向菌丝型态的转换以躲避免疫系统的识别及吞噬细胞的攻击而定植于黏膜与皮肤表面[18]。在本研究中,白色念珠菌感染小鼠的肾脏组织切片结果也证实了其双态性特征,模型组小鼠的肾脏不仅出现大量的真菌积累,且白色念珠菌的形态多为侵染与定植能力更强的菌丝型,而大蒜素治疗后,小鼠肾脏的真菌积累不仅明显减少,形态也转换为酵母菌型,提示大蒜素可能对白色念珠菌的菌丝形成具有调控作用。

目前,大蒜素抗真菌感染的机制研究主要集中于对真菌结构的毒性作用,然而,大蒜素是否能够调控免疫细胞功能以加强抗真菌感染的作用还不明确。中性粒细胞是最丰富的粒细胞类型,占人类总白细胞比例的50%～70%,在真菌感染中发挥重要的吞噬与杀伤作用[19]。在白色念珠菌刺激下,中性粒细胞可通过细胞膜表面的多种模式识别受体,如Dectin-1、TLR2、TLR4,识别真菌细胞壁的β-1,3-葡聚糖,随后激活中性粒细胞内的多个激酶蛋白与信号通路,如Src激酶、Syc激酶、NF-κB及MAPK信号通路,最终释放大量的炎症介质以及ROS,发挥杀菌作用[20]。此外,ROS的大量释放能够触发NETs的形成,当NETs富集到真菌感染位点后,会释放高浓度的组蛋白及抗菌肽等杀菌物质发挥抗菌作用。在本研究中,大蒜素能够剂量依赖性地增强中性粒细胞的杀菌能力并促进ROS的产生以抵抗白色念珠菌的感染,提示大蒜素对中性粒细胞具有免疫调控作用。然而,NETs作为中性粒细胞抵抗真菌感染的另一重要方式,其形成是否也受大蒜素调控有待后续实验证明。

ROS是中性粒细胞抵抗病原微生物感染的重要武器,值得注意的是,作为专职吞噬细胞,中性粒细胞在产生ROS的数量和来源上与其他类型细胞不同[21-22]。在真菌感染过程中,中性粒细胞的ROS主要由质膜、吞噬体膜或细胞器通过NADPH氧化酶复合物产生,其中NOX2(也称作gp91-phox)是NADPH氧化酶复合物中催化活性氧产生的关键组分[23]。在静息状态下,NOX2与其关键的辅助蛋白p47phox分别位于细胞膜与胞浆中,而当细胞受到刺激,如真菌感染时,一系列信号级联反应就会激活p47phox,随后活化的p47phox与细胞膜上的NOX2结合形成活性复合物,并进一步促进NADPH氧化酶复合体的组装(包括辅助蛋白p67phox、p40phox和Rac GTP酶),最终将氧气转化为活性氧,并大量释放至胞外杀灭真菌[24]。此外,有研究表明,p38 MAPK的激活能够促进NADPH氧化酶复合体中关键辅助蛋白p47phox的磷酸化,最终加剧活性氧的产生[25]。同样地,本研究结果表明,大蒜素促进ROS释放的作用依赖于p38 MAPK的激活,并且在白色念珠菌感染过程中,大蒜素能够增强MAPK通路中关键蛋白的磷酸化。然而,大蒜素对MAPK通路的促激活效应是通过直接作用于p38 MAPK还是其上游分子,如PLC、Syk等,仍需要进一步的实验证明。

综上所述,本研究表明在白色念珠菌感染中,大蒜素通过调控中性粒细胞杀菌功能发挥抗真菌作用。在小鼠的白色念珠菌感染模型中,大蒜素显著降低了小鼠肾脏的真菌负荷;体外实验进一步证明,在白色念珠菌刺激下,大蒜素能够增强中性粒细胞对真菌的直接杀伤作用,并剂量依赖性的促进中性粒细胞释放超氧化物;同时,随着大蒜素浓度的升高,MAPK信号通路中关键蛋白的激活也显著增强,而阻断p38 MAPK的激活可以抑制大蒜素对超氧化物产生的促进作用。该发现对于揭示大蒜素的抗菌作用机制提供了新方向,同时也为耐药性真菌感染的研究提供了理论基础。