牛传染性鼻气管炎病毒gB ELISA抗体与中和抗体相关性分析

史喜绢，申超超，张大俊，杨 博，张 婷，郑海学，张克山

（中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 国家口蹄疫参考实验室，兰州 730046）

牛传染性鼻气管炎（infection bovine rhinotrcheitis,IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infection bovine rhinotracheitis virus,IBRV）引起的高度接触性传染病。主要表现为牛上呼吸道炎、结膜炎、传染性脓疱性外阴道炎或龟头包皮炎、新生胎牛的全身性感染，有时也可诱发小牛脑炎等其他类型的疾病[1-2]。该病具有广泛的嗜组织性，且呈世界性分布，给养牛业和乳制品行业造成了不可估量的经济损失[3-4]。IBRV又称牛Ⅰ型疱疹病毒（Bovine herpesvirus 1,BHV-1），属于疱疹病毒科水痘病毒属，只有1个血清型，分4个亚型[5]。该病毒是有囊膜的双股DNA病毒，囊膜蛋白在病毒致病中发挥了重要作用。BHV-1基因组有70多种结构蛋白，其中10种为糖蛋白[6]。gB作为最重要的结构糖蛋白，在病毒吸附、进入细胞及细胞间扩散和融合中起着重要作用，可刺激机体产生大量的中和抗体，是BHV-1中最保守的抗原蛋白[7-8]，也是疫苗研发或诊断的主要靶点[9]。

IBR具有宿主特异性，虽然牛被认为是该病毒唯一的宿主，但也有猪、羊等动物感染本病的报道[10]，病牛和带毒牛为主要的传染源，其中最危险的便为隐性带毒动物[11]。目前，除少数国家彻底消灭了IBRV以外，其他大多数国家均有不同程度的IBRV的流行。1993年全球范围内IBRV的检测率达到了60%，1995年对大型牛场进行IBRV普查，结果表明了IBRV 的检出率为50%，在意大利、新西兰、英格兰等对牛场进行检测，均发现IBRV[12]。我国于1982年首次在从大洋洲进口的牛中分离得到IBRV，但当时对该病毒的危害认识不够深，没有采取及时有效的管控措施，导致该病毒在国内流行[13]。

目前对于IBR的防控主要采用疫苗免疫和扑杀两种措施，欧美一些国家多年坚持对带病牛进行扑杀的策略。而快速有效的诊断IBRV及其评估牛群体内的IBRV抗体对该病的防控显得尤为重要。目前临床上普遍使用ELISA和VNT，在研究牛疱疹病毒4载体疫苗能否引起抗原特异性的保护性免疫反应时，采用ELISA进行BVDV和BoHV-1诊断，利用VNT试验测定中和抗体滴度[14]。ELISA检测灵敏度高易于操作，但ELISA抗体水平高并不能说明一定产生攻毒保护；VNT是评价抗体保护效力的重要方法之一，即VNT抗体水平高意味着能免受病毒攻击，但VNT操作复杂耗时较长，对试验人员及环境要求较高，不适用于临床检测。gB虽然可以作为IBRV诊断和治疗研究的靶点，但目前尚无使用gB ELISA抗体水平评估牛群中IBRV抗体保护效果的报道。因此，本研究试对某牛场采集的50份血清进行gB ELISA抗体检测，利用VNT试验对本次血清样品进行IBRV中和抗体的检测，目的是探索IBRV gB抗体和中和抗体效价的相关性，为使用gB ELISA抗体评估牛群对IBRV抗体抵抗病毒感染能力及简便评估疫苗保护效价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 血清样本采自某IBRV发病且康复奶牛场。牛肾细胞（madin-darby bovine kidney,MDBK）及IBRV由本实验室提供。CIVTEST BOVIS IBRgB抗体试剂盒购自天科生物科技有限公司；细胞培养用胎牛血清、链霉素，青霉素、0.25%Trypsin及MEM培养基均购自Gibco公司；血细胞计数仪购自SYSMIX公司；BioTek多功能酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。

1.2 阻断ELISA检测方法 包被板上加入100 μL阳性、阴性对照及待检血清样品；在36℃～38℃条件下孵育60 min；弃去板中液体，洗板4次；加入100 μL酶标记物，轻轻混匀后在36℃～38℃条件下孵育60 min；弃液洗4次；加入100 μL底物液，混匀2 s；在室温20℃～25℃条件下避光孵育10 min；加入100 μL终止液。选择酶标仪450 nm波长进行测定，阴性对照阻断率（IN%）大于0.65%，阳性对照（IN%）大于60%时试验成立。血清样品结果判定：IN%＜35%，判定为IBRV抗体阴性；IN%＞35%，判定为IBRV抗体阳性。

1.3 血清VNT检测方法 血清灭活，取IBRV阳性血清、阴性血清和待检血清各650 μL，置56℃水浴30 min。血清稀释：用维持培养液将待检血清均作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释，同时设标准阴阳性血清对照。毒株的稀释：将IBRV用维持培养液稀释至100 TCID50/0.1mL。混合IBRV分别与待检血清和标准阴阳性血清等量混合，置37℃孵育4 h。接种细胞：将100 μL混合液加入单层MDBK细胞的96孔培养板中，做4个重复，同时设阳性和阴性细胞对照，置37℃、5% CO2温箱中培养，逐日观察并记录CPE，共观察7 d。结果判定，在阴阳性对照成立的条件下，待检血清以至少1/2孔均没有出现CPE的血清最大稀释度为中和抗体效价。

1.4 相关性分析 通过统计学的分析判断IBRV gB ELISA抗体IN%值与中和抗体效价值的相关性，相关系数的计算公式[15]如下：

x为血清样本中和抗体效价平均值的倒数；y为血清样本gB ELISA抗体平均S/P值；n为gB ELISA抗体S/P值分段组。如果r＞0，表示其为正相关；r＜0，表示其为负相关。一般来说，相关系数取绝对值后，0.09为没有相关性，0.1～0.3为弱相关，＞0.3～0.5为中等相关，＞0.5～1.0为强相关。

2 结果

2.1 ELISA检测gB抗体结果 以50份待检血清，阴性及阳性对照进行阻断IBRV gB-ELISA检测，结果显示，阳性19份，阴性31份（表1）。

表1 IBRV gB-ELISA检测结果Table 1 IBRV gB-ELISA test results

2.2 VNT检测中和抗体结果 对50份待检血清进行中和抗体检测，结果显示中和抗体＞2的有17份，＜2的有33份（表2）。

表2 IBRV中和抗体检测结果Table 2 IBRV neutralizing antibody test results

2.3 血清中和抗体效价和gB抗体的相关性 在50份血清中，抗体IN%值大于0.35的有16份血清，平均IN%值为0.7739，相应的血清中和抗体效价倒数平均值为9.17；gB抗体IN%值小于0.35的有34份血清，平均IN%值为0.1371，相应的血清中和抗体效价倒数平均值为2（表3）。通过生物统计学分析发现，gB抗体平均IN%值和中和抗体效价倒数平均值成正相关，相关系数为1.0，具有强相关性。

表3 gB ELISA抗体平均IN%值和中和抗体效价倒数平均值Table 3 The average IN% of gB ELISA antibody and the reciprocal average of neutralizing antibody titer

3 讨论

IBR是一种免疫抑制病，感染牛群出现一系列呼吸道症状，使育肥牛群的生长延缓、奶牛产奶量降低甚至停乳、怀孕母牛流产等，造成严重的经济损失[16-17]。该病被世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health,OIE）列为B类动物传染病，据报道我国牛群IBRV血清阳性率约46%，时有IBRV局部流行，目前对该病的血清学诊断主要依靠实验室的VNT或ELISA检测，尚无自主研发的商品化的IBRV血清抗体检测试剂盒[18]。因此省时省力的IBRV抗体检测方法对该病的防控十分重要。

gB蛋白是IBRV主要的抗原蛋白，且高度保守[19]。gB蛋白主要参与病毒颗粒吸附到细胞表面以及入侵细胞的过程，并且gB 蛋白有2个T细胞识别表位和3个B细胞的识别表位，因此在病毒入侵过程中能够诱发机体产生较强的特异性免疫反应，gB也能产生保护性中和抗体[20]。基于以上特性，gB基因已成为IBRV诊断和治疗研究的热点[21]。本研究对某牛场50份血清进行gB ELISA抗体检测，阳性19份，阴性31份。随后对这50份血清进行中和抗体检测，中和抗体大于2的有17份，中和抗体小于2的有33份。虽然目前IBRV的诊断试剂大多数是针对gB抗原表位，gB也有一定的免疫调节潜力[22]，但尚无使用gB ELISA抗体检测IBRV保护效果的研究。ELISA方法由于在实际操作中简便快捷、敏感性高、成本较低等诸多优点，使其得到广泛应用；病毒中和试验耗时较长，工作量较大，敏感性也参差不齐。因此本研究利用gB ELISA抗体评估疫苗的保护效果。

本研究对血清gB ELISA抗体和病毒中和试验两种方法检测结果进行统计学分析，发现血清gB抗体平均阻断率和中和抗体效价平均值具有较强的相关性，相关系数为1.0。本研究发现gB ELISA抗体平均阻断率和中和抗体效价平均值的相关系数为0.5～1.0，具有较强的正相关。IBRV 结构蛋白gB、gC、gD，TK均能刺激机体产生抗体，可以针对IBRV毒力与保护性相关成分，研发更安全和有效的IBRV疫苗[23]。中和抗体效价越高抗体保护的效果越好，使机体免受病毒的感染[24]，因此通过检测gB抗体阻断率来衡量牛群对IBRV的抵抗力强弱基本可以评估其保护效价的高低，这为使用gB ELISA抗体水平的方法快速简便评估牛群中IBRV抗体保护效果提供数据支持，更有利于IBR的防控。