缺氧环境下外源性雌激素对子宫内膜癌细胞上皮间充质转化的影响及其机制

高英华，孙雯雯，靳凯宇，翟晓茜，谢浩，张毅芳，安霞，张亚，田伟，刘蕾，柳雅玲

1 山东第一医科大学第二附属医院病理科，山东泰安271000；2 福建省立医院南院病理科；3 山东医药技术学院生物工程系；4 山东第一医科大学第二附属医院妇科；5 山东第一医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科；6 山东第一医科大学附属省立医院妇科；7 山东第一医科大学（山东省医学科学院）临床与基础医学院

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率逐年升高并且发病人群呈年轻化趋势。子宫内膜癌通常可分为雌激素依赖型和非雌激素依赖型两种。其中，雌激素依赖型约占所有子宫内膜癌的85%［1］。雌激素与肿瘤细胞表面的雌激素受体（ER）结合可激活多种信号通路，在子宫内膜癌形成及浸润、转移中发挥重要作用［2］。缺氧是肿瘤微环境的一个显著特征，可诱导肿瘤细胞增强侵袭和迁移能力［3］。缺氧微环境能够上调缺氧诱导因子1（HIF-1）表达，而HIF-1α是HIF-1的活性亚基，其调控的靶基因可参与肿瘤细胞的浸润、侵袭和迁移等生物学过程［4-6］。上皮间充质转化（EMT）是触发肿瘤细胞侵袭和迁移的关键事件［7］。而缺氧和雌激素均能通过多种信号通路激活EMT，如转化生长因子β1（TGF-β1）、Wnt/β-catenin信号通路。2019年9月—2022年3月，本研究探讨了缺氧环境下外源性雌激素对子宫内膜癌细胞EMT的影响及其机制。现报告如下。

1.料与方法

1.1.料 ER阳性的子宫内膜癌细胞Ishikawa，购自上海复祥生物科技有限公司。β-雌二醇，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。HIF-1α过表达载体（HA-HIF-1α-pcDNA3），购自北京中源合聚生物科技有限公司。所有引物由上海桑尼生物科技有限公司设计合成。siRNA-HIF-1α（5'-CAAAGUUCACCUGAGCCUAdTdT-3'）、siRNA-NC（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'），由上海希格玛生物科技有限公司设计合成。Roche LightCycler®96 Real-time PCR系统，购自罗氏诊断产品（上海）有限公司；Spectra Max Plus 384全波长酶标仪，购自美国Molecular Devices公司；ChemiDoc XRS + 凝胶成像系统，购自美国Bio-Rad公司。超纯RNA提取试剂盒、HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit、UltraSYBR Mixture，购自北京康为世纪生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；Lipofectamine 2000，购自上海希格玛生物科技有限公司。HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1、β-catenin、GAPDH一抗及山羊抗兔IgG H&L二抗，购自上海优宁维生物科技股份有限公司。

1.2.胞培养 取冻存的Ishikawa细胞，置于37 ℃恒温水浴锅中迅速解冻复苏，然后接种于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。每2～3天更换一次培养基。待细胞生长融合90%以上时，胰蛋白酶消化，按1∶3传代。取传3代、对数生长期、生长状态良好的Ishikawa细胞进行后续实验。

1.3.胞分组与干预 取Ishikawa细胞接种于6孔板，每孔2.5 × 105个，常规培养24 h。取部分Ishikawa细胞，于0.5% O2、5% CO2、94.5% N2环境中缺氧预处理2 h，随机分为siRNA-HIF-1α组与siRNA-NC组、HIF-1α过表达组与Control组，按Lipofectamine 2000说明，siRNA-HIF-1α组、siRNA-NC组、HIF-1α过表达组分别转染siRNA-HIF-1α、siRNA-NC、HA-HIF-1α-pcDNA3，Control组不予转染，转染24 h收集细胞。另取部分Ishikawa细胞，于0.5% O2、5% CO2、94.5% N2环境中缺氧预处理2 h后加入0.01 μmol/L β-雌二醇，随机分为Estrogen组、Estrogen + siRNA-NC组、Estrogen + siRNA-HIF-1α组以及Estrogen组、Control组、Estrogen + HIF-1α过表达组，按Lipofectamine 2000说明，Estrogen + siRNA-NC组、Estrogen + siRNA-HIF-1α组、Estrogen + HIF-1α过表达组分别转染siRNA-NC、siRNA-HIF-1α、HA-HIF-1α-pcDNA3，Estrogen组不予转染，转染24 h收集细胞。

1.4.IF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。收集上述各组细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，提取的总RNA纯度和浓度合格。按HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit说明，将总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。采用Roche LightCycler®96 Real-time PCR系统，以cDNA为模板，按UltraSYBR Mixture说明进行PCR扩增。引物序列：HIF-1α上游引物5'-AGTGTACCCTAACTAGCCG-3'、下游引物5'-CGAACCACGACTAAACAC-3'，E-cadherin上游引物5'-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT-3'、下游引物5'-TCCCAGGCGTAGAGGCTT-3'，N-cadherin上游引物5'-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3'、下游引物5'-ATGCACATTCCTTCGATAAGACTG-3'，β-catenin上游引物5'-AGCTTCCAGACACGCTTCAT-3'、下游引物5'-CGGTACAACGCTGTTTCTA-3'，TGF-β1上游引物5'-GTGGAGGATGAGGATGAGGA-3'、下游引物5'-CTCGGCATTTCTCTCTCTGC-3'，GAPDH上游引物5'-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3'、下游引物5'-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3'。PCR反应体系共50 μL：2 × UltraSYBR Mixture（Low ROX） 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 21 μL；反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃30 s共40个循环。PCR反应结束，绘制熔解曲线，获取循环阈值（CT）数。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。

1.5.IF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集上述各组细胞，RIPA裂解液冰上充分裂解，提取细胞总蛋白，经BCA法蛋白定量合格。将蛋白样品与SDS及巯基乙醇混合后加热，使蛋白充分变性。取变性蛋白20 μg，SDS-PAGE分离。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别滴加HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1、GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜。次日，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h。ECL发光，避光保存并转移至凝胶成像分析系统，在化学光敏模式下曝光、显影。采用ChemiDoc XRS + 凝胶成像系统分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.6.计学方法 采用GraphPad Prism 7.0统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Student'st检验；两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.果

2.1.氧环境下子宫内膜癌细胞HIF-1α基因沉默或过表达后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表达变化 见表1～4。

表1.氧环境下子宫内膜癌细胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相对表达量变化（±s）

表1.氧环境下子宫内膜癌细胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相对表达量变化（±s）

注：与siRNA-NC组比较，*P＜0.05。

组别siRNA-HIF-1α组siRNA-NC组HIF-1α 0.48 ± 0.02*8.50 ± 0.19 E-cadherin 4.56 ± 0.15*0.24 ± 0.02 N-cadherin 0.65 ± 0.03*9.27 ± 0.42 β-catenin 0.24 ± 0.01*2.39 ± 0.10 TGF-β1 0.28 ± 0.01*10.18 ± 0.32

表2.氧环境下子宫内膜癌细胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相对表达量变化（±s）

表2.氧环境下子宫内膜癌细胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相对表达量变化（±s）

注：与siRNA-NC组比较，*P＜0.05。

组别siRNA-HIF-1α组siRNA-NC组TGF-β1 0.25 ± 0.02*0.72 ± 0.01 HIF-1α 0.41 ± 0.01*0.91 ± 0.01 E-cadherin 0.52 ± 0.01*0.41 ± 0.01 N-cadherin 0.49 ± 0.04*1.58 ± 0.02 β-catenin 0.23 ± 0.01*0.39 ± 0.01

表3.氧环境下子宫内膜癌细胞HIF-1α过表达后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相对表达量变化（±s）

表3.氧环境下子宫内膜癌细胞HIF-1α过表达后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相对表达量变化（±s）

注：与Control组比较，*P＜0.05。

组别HIF-1αE-cadherin N-cadherin β-catenin TGF-β1 HIF-1α过表达组Control组12.22 ± 0.29*1.00 ± 0.01 0.40 ± 0.01*1.00 ± 0.02 14.73 ± 0.36*1.00 ± 0.01 6.52 ± 0.27*1.00 ± 0.03 6.64 ± 0.18*1.00 ± 0.02

表4.氧环境下子宫内膜癌细胞HIF-1α过表达后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1蛋白相对表达量变化（±s）

表4.氧环境下子宫内膜癌细胞HIF-1α过表达后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1蛋白相对表达量变化（±s）

注：与Control组比较，*P＜0.05。

组别HIF-1α过表达组Control组1.38 ± 0.03*0.86 ± 0.03 0.31 ± 0.01*0.36 ± 0.01 2.31 ± 0.03*1.81 ± 0.04 0.51 ± 0.01*0.41 ± 0.02 1.35 ± 0.03*0.82 ± 0.04 HIF-1αE-cadherinN-cadherinβ-cateninTGF-β1

2.2.氧环境下子宫内膜癌细胞加入雌激素同时HIF-1α基因沉默或过表达后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表达变化 见表5～8。

表5.氧环境下子宫内膜癌细胞加入雌激素同时HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相对表达量变化（±s）

表5.氧环境下子宫内膜癌细胞加入雌激素同时HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相对表达量变化（±s）

注：与Estrogen组比较，*P＜0.05；与Estrogen + siRNA-NC组比较，#P＜0.05。

组别Estrogen组Estrogen + siRNA-NC组Estrogen + siRNA-HIF-1α组HIF-1α 11.37 ± 0.45 24.32 ± 0.56*0.37 ± 0.02*#E-cadherin 0.52 ± 0.03 0.37 ± 0.02*8.28 ± 0.20*#N-cadherin 7.45 ± 0.38 10.74 ± 0.42*0.55 ± 0.04*#β-catenin 7.90 ± 0.15 8.18 ± 0.38*0.17 ± 0.01*#TGF-β1 13.85 ± 0.45 11.21 ± 0.58*0.28 ± 0.02*#

表6.氧环境下子宫内膜癌细胞加入雌激素同时HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相对表达量变化（±s）

表6.氧环境下子宫内膜癌细胞加入雌激素同时HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相对表达量变化（±s）

注：与Estrogen组比较，*P＜0.05；与Estrogen + siRNA-NC组比较，#P＜0.05。

组别Estrogen组Estrogen + siRNA-NC组Estrogen + siRNA-HIF-1α组HIF-1α 1.13 ± 0.06 1.19 ± 0.04*0.87 ± 0.04*#E-cadherin 0.27 ± 0.01 0.53 ± 0.02*0.63 ± 0.01*#N-cadherin 1.26 ± 0.06 1.47 ± 0.03*1.06 ± 0.05*#β-catenin 0.39 ± 0.01 0.48 ± 0.01*0.33 ± 0.01*#TGF-β1 0.98 ± 0.03 0.82 ± 0.03*0.43 ± 0.02*#

表7.氧环境下子宫内膜癌细胞加入雌激素同时HIF-1α过表达后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相对表达量变化（±s）

表7.氧环境下子宫内膜癌细胞加入雌激素同时HIF-1α过表达后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相对表达量变化（±s）

注：与Estrogen组比较，*P＜0.05；与Control组比较，#P＜0.05。

组别Estrogen组Control组Estrogen + HIF-1α过表达组HIF-1α 11.37 ± 0.45 1.00 ± 0.02*28.61 ± 0.71*#E-cadherin 0.52 ± 0.03 1.00 ± 0.01*0.12 ± 0.01*#N-cadherin 7.45 ± 0.38 1.00 ± 0.03*14.83 ± 0.38*#β-catenin 7.90 ± 0.15 1.00 ± 0.01*15.36 ± 0.41*#TGF-β1 13.85 ± 0.45 1.00 ± 0.01*18.43 ± 0.36*#

表8.氧环境下子宫内膜癌细胞加入雌激素同时HIF-1α过表达后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相对表达量变化（±s）

表8.氧环境下子宫内膜癌细胞加入雌激素同时HIF-1α过表达后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相对表达量变化（±s）

注：与Estrogen组比较，*P＜0.05；与Control组比较，#P＜0.05。

组别Estrogen组Control组Estrogen + HIF-1α过表达组HIF-1α 1.13 ± 0.06 0.81 ± 0.03*1.38 ± 0.03*#E-cadherin 0.27 ± 0.01 0.45 ± 0.02*0.21 ± 0.01*#N-cadherin 1.26 ± 0.06 1.12 ± 0.02*1.85 ± 0.03*#β-catenin 0.39 ± 0.01 0.24 ± 0.01*0.51 ± 0.01*#TGF-β1 0.98 ± 0.03 0.71 ± 0.01*1.14 ± 0.08*#

3.论

子宫内膜癌是起源于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，好发于围绝经期及绝经后妇女，近年来其发病率逐年升高并且发病人群呈年轻化趋势。但目前子宫内膜癌的病因和发病机制尚不完全清楚。

缺氧是肿瘤微环境的一个显著特征，在不同类型恶性肿瘤中均能检测到HIF-1α表达显著升高。在缺氧环境下，HIF-1α过表达能够引起肿瘤细胞发生EMT，进而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移［8-9］。在雌激素依赖型子宫内膜癌中，雌激素与其受体结合，从而发挥一系列生物学作用，如促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡以及促进肿瘤血管生成等。有研究报道，雌激素诱导的EMT可能在子宫内膜癌细胞的侵袭和迁移中发挥重要作用［10］。但缺氧环境下雌激素在子宫内膜癌细胞EMT中的作用尚不明确。本研究结果显示，siRNA-HIF-1α组HIF-1α mRNA和蛋白相对表达量均低于siRNA-NC组；HIF-1α过表达组HIF-1α mRNA和蛋白相对表达量均高于Control组。结果表明，HIF-1α能够参与子宫内膜癌细胞对缺氧的适应性调节。而HIF-1α过表达可激活恶性肿瘤的许多重要特征，如肿瘤血管生成以及肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等，在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。

EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，是触发肿瘤细胞侵袭和迁移的关键事件［7］。E-cadherin表达下调或缺失、N-cadherin表达上调是EMT的典型特征。EMT可导致上皮性肿瘤细胞侵袭和迁移能力增强［11-12］。缺氧和雌激素均能通过多种信号通路激活EMT，如TGF-β1、Wnt/β-catenin信号通路。因此，TGF-β1、β-catenin等信号通路中的关键因子异常表达亦可导致恶性肿瘤的发生、发展［13］。本研究结果显示，siRNA-HIF-1α组N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相对表达量均低于siRNA-NC组，E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量均高于siRNA-NC组；HIF-1α过表达组N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相对表达量均高于Control组，E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量均低于Control组。结果提示，在缺氧环境下HIF-1α能够负向调节E-cadherin表达，正向调节N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表达。

本研究结果还显示，Estrogen + siRNA-HIF-1α组HIF-1αmRNA和蛋白相对表达量均低于Estrogen +siRNA-NC组和Estrogen组；Estrogen + HIF-1α过表达组HIF-1α mRNA和蛋白相对表达量均高于Estrogen +siRNA-NC组和Estrogen组，表明雌激素能够参与缺氧过程并上调HIF-1α表达。进一步研究发现，Estrogen + siRNA-HIF-1α组N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相对表达量均低于Estrogen +siRNA-NC组和Estrogen组，E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量均高于Estrogen + siRNA-NC组和Estrogen组；Estrogen + HIF-1α过表达组N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相对表达量均高于Estrogen组和Control组，E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量均低于Estrogen组和Control组。结果提示，在缺氧环境下雌激素下调E-cadherin表达以及上调N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表达可能是通过HIF-1α来实现的。

综上所述，缺氧环境下雌激素可能通过激活HIF-1α来促进子宫内膜癌细胞EMT。但在缺氧环境下雌激素参与子宫内膜癌细胞EMT的具体机制尚需进一步研究。