慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清miR-181a和Smad7 mRNA表达变化及其临床意义

梁颖隽，张小瑜，李小波

1 中国人民解放军西部战区空军医院呼吸与危重症医学科，成都610021；2 成都市第七人民医院呼吸与危重症医学科

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以持续性气流受限为特征的慢性气道炎症性疾病。近年来，随着人口老龄化进程加速和环境污染加剧，我国COPD的发病率逐年上升，COPD已成为影响我国居民健康的重要公共卫生问题之一［1］。慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）是指在疾病过程中，短期内咳嗽、咳痰、气短和（或）喘息加重、痰量增多，呈脓性或黏液脓性，可伴发热或其他症状，是导致患者住院和死亡的重要原因［2］。因此，准确评估AECOPD及其病情严重程度，是COPD患者个体化评估与管理策略的关键。慢性气道炎症和气道重塑是COPD发生、发展的病理生理基础［3］。微小RNA（miRNA）是一类具有调控功能的内源性非编码小分子RNA。有研究证实，miRNA能够通过对免疫系统的调节在呼吸系统炎症反应中扮演重要角色［4］。miR-181a是一种体内组织炎症应激性miRNA，其基因定位于人染色体1q32.1。有研究通过加权基因共表达网络分析发现，COPD患者外周血miR-181a异常表达［5］。Smad同源物7（Smad7）是一种重要的抑制型Smad蛋白，可通过多种途径抑制转化生长因子β（TGF-β）信号通路激活，进而抑制气道炎症反应［6］。虽然miR-181a、Smad7均能参与呼吸系统炎症反应，但二者与AECOPD病情严重程度和气道重塑的关系尚不清楚。鉴于此，本研究观察了AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表达变化，并探讨二者表达变化与病情严重程度和气道重塑的关系。现报告如下。

1.料与方法

1.1.床资料 选择2020年5月—2022年5月中国人民解放军西部战区空军医院呼吸科收治的AECOPD患者121例（AECOPD组）、慢性阻塞性肺疾病稳定期（SCOPD）患者45例（SCOPD组）。AECOPD和SCOPD诊断依据《慢性阻塞性肺疾病基层诊疗指南（2018年）》［7］。纳入标准：①符合AECOPD、SCOPD诊断标准；②年龄≥18岁；③病历资料完整。排除标准：①合并肺结核、支气管哮喘、间质性肺病等其他肺部疾病者；②合并造血系统、免疫系统、精神或神经系统损害者；③合并恶性肿瘤者；④合并心、肝、肾等重要脏器严重功能障碍者；⑤既往有心、肺手术史者；⑥长期滥用药物或有药物依赖史者。其中，AECOPD组男85例、女36例，年龄36～87（61.85 ± 8.17）岁，BMI 18.54～28.82（22.68 ±2.19）kg/m2，病情严重程度［8］：轻度52例、中度46例、重度23例；SCOPD组男32例、女13例，年龄32～85（60.41 ± 7.26）岁，BMI 17.91～28.11（22.42 ±2.07）kg/m2。另选同期在中国人民解放军西部战区空军医院体检健康的志愿者42例（对照组），男31例、女11例，年龄24～78（59.72 ± 7.16）岁，BMI 18.09～27.53（22.81 ± 1.98）kg/m2。三组性别、年龄、BMI具有可比性。本研究经中国人民解放军西部战区空军医院伦理委员会批准（批准文号：2020-02-142），所有研究对象或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2.清miR-181a、Smad7 mRNA表达检测 所有研究对象入组后采集空腹外周静脉血3 mL，1 500×g离心10 min，留取上层血清。采用TRIzol法提取血清总RNA，经Nano-300微量分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。按逆转录试剂盒说明，将总RNA逆转录合成为cDNA。以cDNA为模板，按PCR扩增试剂盒说明进行扩增。所有引物序列由上海新贝生物科技有限公司设计合成。引物序列：miR-181a上游引物5'-GTCCAGATGCTGTACCTTCCTC-3'、下游引物5'-GCGAGTCTTCTCCCCAGTAT-3'，内参U6上游引物5'-AGCGCCTTGACCTGGACA-3'、下游引物5'-TCGGCGTGCTCTGGAAAA-3'；Smad7上游引物5'-GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC-3'、下游引物5'-GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA-3'，内参GAPDH上游引物5'-CCGAGGGTCATCGATGACGT-3'、下游引物5'-ACAATTCCCACTTTGAGCTC-3'。PCR反应体系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，2 × TransStart®Top Green qPCR SurperMix 10 μL，无核酸酶水8 μL；反应条件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃30 s、72 ℃ 15 s共40个循环。PCR反应结束，绘制熔解曲线，获取循环阈值（CT）数。分别以U6或GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算血清miR-181a、Smad7 mRNA相对表达量。

1.3.道重塑评价 所有研究对象入组后接受胸部CT扫描。取仰卧位，双臂上举，屈曲抱头，采用16排螺旋CT行胸部高分辨率扫描，测量气道腔内径（L）、气道腔外径（D）、气道壁面积（WA）、气道总横截面积，计算气道壁厚度（T）与D比值（T/D）、WA占气道总横截面积百分比（WA%）。T/D=（D/2-L/2）/D，WA%=（气道总横截面积-WA）/气道总横截面积。

1.4.计学方法 采用SPSS28.0统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用非参数检验，进一步两两比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson或Spearman相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.果

2.1.组血清miR-181a、Smad7 mRNA表达以及T/D、WA%比较 见表1。

表1.组血清miR-181a、Smad7 mRNA表达以及T/D、WA%比较

2.2.同病情严重程度AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表达以及T/D、WA%比较 见表2。

表2.同病情严重程度AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表达以及T/D、WA%比较

2.3.ECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表达与病情严重程度和气道重塑的关系 Pearson相关分析显示，AECOPD患者血清miR-181a表达与Smad7 mRNA表达呈正相关关系（r=0.716，P＜0.01）。Spearman相关分析显示，AECOPD患者血清miR-181a表达与病情严重程度和WA%、T/D均呈负相关关系（rs分别为-0.662、-0.681，P均＜0.01），血清Smad7 mRNA表达与病情严重程度和WA%、T/D亦均呈负相关关系（rs分别为-0.667、-0.672，P均＜0.01）。

3.论

COPD是临床最常见的慢性气道炎症性疾病，其病理学改变主要是气道和（或）肺泡异常。COPD的发生通常认为与气道和肺脏对有害颗粒或气体的慢性炎症反应增强有关。AECOPD不仅会加重患者主诉症状，还会引起多器官或系统功能损伤，是导致患者住院和死亡的重要原因［8-9］。在我国COPD患者每年发生0.5～3.5次急性加重，并且首次发生急性加重后，急性加重风险和病情严重程度会进一步增加，难以恢复至急性加重前状态。但现阶段临床较多AECOPD患者病情未能及时得以评估和控制，最终引起心脑血管合并症、呼吸衰竭甚至死亡［10］。因此，准确评估AECOPD及其病情严重程度，是COPD患者个体化评估与管理策略的关键。

气道炎症是COPD发生、发展的病理生理基础之一，而持续的气道炎症能够引起气道上皮反复损伤和修复，驱动气道重塑导致气流受限、黏液分泌增多和肺泡被破坏，从而促进AECOPD的发生、发展［2］。近年随着对表观遗传学研究的不断深入，越来越多证据表明，miRNA能够通过引起mRNA降解或转录后基因沉默参与COPD的发生、发展［4］。miR-181a是一个与炎症反应高度相关的miRNA，可参与炎症性疾病的发生、发展。张瑜等［11］研究报道，miR-181a能够通过Th17/Treg抑制急性胰腺炎患者炎症反应。LIU等［12］研究表明，miR-181a能够靶向肿瘤坏死因子α改善糖尿病肾病的炎症反应。在急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征动物模型中发现，上调miR-181a表达能够抑制肺部炎症［13］。上述研究表明，miR-181a作为一种抗炎miRNA可参与AECOPD的发生、发展。本研究结果显示，对照组、SCOPD组、AECOPD组血清miR-181a表达依次降低；随着AECOPD患者病情加重，血清miR-181a表达逐渐降低。结果提示，血清miR-181a表达降低与AECOPD的发生、发展密切相关。

TGF-β信号通路是调节免疫炎症反应的重要信号通路，其介导的炎症反应与气道炎症密切相关［14］。Smad是TGF-β家族受体下游的信号转导分子。Smad7是一种重要的抑制型Smad蛋白，能够通过与转录抑制剂相互作用或干扰Smad-DNA复合物形成，抑制TGF-β/Smad信号通路，继而抑制炎症反应［6，15］。本研究结果显示，对照组、SCOPD组、AECOPD组血清Smad7 mRNA表达依次降低；随着AECOPD患者病情加重，血清Smad7 mRNA表达逐渐降低。结果表明，血清Smad7 mRNA表达降低与AECOPD的发生、发展亦密切相关。

T/D、WA%是临床评估气道重塑的常用指标。COPD患者由于气道上皮反复损伤和修复可导致气道重塑，故T/D、WA%会显著升高［2］。本研究结果显示，对照组、SCOPD组、AECOPD组T/D和WA%依次升高；随着AECOPD患者病情加重，T/D和WA%逐渐升高。结果表明，AECOPD患者存在明显的气道重塑情况，并且病情严重程度越重，气道重塑越明显。

本研究相关性分析发现，AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表达与WA%、T/D均呈负相关关系。提示血清miR-181a、Smad7 mRNA表达降低可通过促进气道重塑参与AECOPD病情进展。究其原因，miR-181a具有抗炎作用，其表达下调可导致气道炎症持续发展，从而促进气道重塑，最终导致病情加重［16］；Smad7能够抑制TGF-β/Smad信号通路介导的气道炎症，而Smad7 mRNA表达下调则导致TGF-β/Smad信号通路激活，从而促进气道炎症持续发展并进展为气道重塑［17］。本研究结果还发现，AECOPD患者血清miR-181a表达与Smad7 mRNA表达呈正相关关系，提示二者可能协同促进气道重塑继而参与AECOPD进展。最近王雅杰等［18］研究证实，上调miR-181a表达可诱导Smad7表达上调，进而改善COPD大鼠气道重塑。但二者协同作用的具体机制尚不清楚，还需进一步研究。

综上所述，AECOPD患者血清miR-181a、Smad7 mRNA表达降低，二者表达变化与病情严重程度和气道重塑密切相关。