光遗传学技术治疗心房颤动的作用机制及应用研究进展

程锦潇，王晞

武汉大学人民医院心内科 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室，武汉 430060

光遗传学技术是21世纪备受关注的细胞生物学研究技术，它结合了遗传学与光控技术，通过将光敏感蛋白特异性表达在可兴奋细胞的细胞膜上，再利用特定波长的光照激活光敏感蛋白以控制离子的跨膜流动，从而实现细胞膜的去极化或超极化［1］。光遗传学技术的起源最早可追溯到上世纪70年代，由OESTERHELT和STOECKENIUS两位科学家在嗜盐杆菌的紫膜上发现了一种与视紫红质结构相似的蛋白质，在光照条件下可以被激活，将质子泵出细胞外［2］。从此，学术界针对光敏感蛋白展开了一系列的研究，其中突破最大的是BOYDEN等［3］将视紫红质通道蛋白2（ChR2）表达在哺乳动物的神经元上，实现了光照对特定神经元的精细调控。DEISSEROTH 等［4］于次年首次提出光遗传学这一概念，将其定义为一种将遗传学技术与光学操作相结合，以实现光对组织器官精细调控的新技术。光遗传学技术于2010年被正式引入心脏电生理研究，ARRENBERG等［5］和BRUEGMANN 等［6］先后将光遗传学应用于转基因斑马鱼及小鼠的心肌细胞，并进行心脏节律研究，从此光遗传学技术逐渐应用于终止心律失常、光起搏和心脏再同步治疗等［7］。心房颤动（简称房颤）是目前最常见的快速性心律失常，具有很高的致死率和致残率［8］。复律治疗不仅能有效改善患者的临床症状，也能预防血栓形成，在一定程度上还能阻止房颤的自然进展，提高患者的生活质量［9］。与传统的房颤复律措施相比，光遗传学技术有着更高的时空分辨率，可以应用光照对心房内的异常放电部位进行调控，因而基于光遗传学技术的房颤复律治疗得到了国内外学者的广泛关注。本文就光遗传学技术终止房颤发作的相关机制及其应用情况作一综述，为房颤的复律治疗提供一种新的选择。

1 光遗传学技术治疗房颤的作用机制

1.1 房颤的发病机制及“转子”学说 房颤是一种复杂的持续性心律失常，尽管近年来学术界针对其发病机制做出了一系列的探索，但是我们对于房颤的确切发病机制仍然缺少一个明确的认识［10］。目前，被学术界广泛认同的观点是房颤的发生发展机制可以分为触发机制和维持机制［11］。HAISSAGUERRE等［12］早期提出，引发房颤的异位电活动95%来自于肺静脉肌袖，其余5%来自于上下腔静脉。据此，环肺静脉隔离术成为房颤导管消融的基础术式。之后，除了腔静脉和肺静脉的其他心脏解剖结构，如Marshall韧带、左心耳、右心耳、卵圆窝等，作为房颤的异位激活灶也相继被证实［13］。然而，心腔的异位电激活并不是引起房颤发作的充分必要条件，有研究表明正常人的心脏内也会发生异常电活动［14］。房颤被触发之后，其发作具有不确定性，有的发作是短暂的，有的发作是持续性的，甚至在没有异位激活的时候仍然可以出现房颤的发作［9］。所以房颤的形成除了有触发因素之外，维持因素的存在也起到了不可忽视的作用。目前广泛认可的房颤维持机制有“多子波折返”学说、局灶驱动伴颤动样传导以及近年来备受关注的“转子”学说。转子是一种螺旋形、杂乱无章的电活动，围绕着一个不可激发的核心［15］。在离体心脏实验中已经证明了转子的存在，单个转子可以引起单形性快速心律失常，额外的转子可以引起多形性快速心律失常［16］。最近的研究表明，光遗传学可以对心房内的转子进行操控，利用转子可漂移的特性对其进行靶向消除［17］。

1.2 光遗传学技术对转子的消除作用 转子是心肌组织中围绕着一个不可激发的核心而形成的一种呈螺旋形且杂乱无章的电活动，目前转子被广泛认为是房颤发生的驱动灶。心肌组织的兴奋性改变可以导致转子核心的移位，奠定了光遗传学技术消除转子治疗房颤的可行性。FEOLA等［18］将ChR2表达在新生大鼠心房肌细胞（nraCMC）上，随后通过S1-S2光交叉场刺激，在大鼠心房肌细胞上成功诱导出单个、稳定、集中的转子，然后通过精确的光定位在转子的核心或者周边区域诱导出圆形或条块状的光传导块；当在转子核心区域被局部照射诱导出圆形光传导块时，出现到了两种同时发生的现象，即出现了一个新的电波和形成了功能性传导阻滞；在光传导块的作用下，新的电波与现有转子激活的前沿发生碰撞，因而产生了新的折返波，新的折返波被锚定到被诱导功能性传导阻滞的照明区，从而维持心律失常活动。所以，在转子核心区域局部照射诱导出圆形光传导块时没有终止转子，而是将转子核心区靶向转化一种新的折返回路；随后在转子核心区域诱导出经过核心的条块状光传导块时，出现了与之前一样的现象；但是当FEOLA等［18］将nraCMC上光传导块的长度延长至穿过核心，并达到至少一个不可激发的边界时，转子沿着传导块向不可激发的边界漂移，并与之发生碰撞而消失。因此，转子漂移的机制可能是持续局部光照导致心肌细胞兴奋性降低而产生了一个兴奋性梯度，使得转子向兴奋性低的地方漂移。随后，MAJUMDER等［19］通过光诱导兴奋性梯度诱导了两个转子的对向移动，使得转子核心区域发生碰撞，结果两个转子核心相互碰撞之后转子也随之消失。以上实验证明，光遗传学技术可以通过诱导产生局部光传导块而终止房颤，但是需要传导块经过转子核心，且到达至少一个不可激发的边界的块状线，又或者可以通过诱导转子间的碰撞而终止房颤，这一重大发现提高了光遗传学技术对转子消融机制的理解。

2 光遗传学技术在房颤治疗中的应用

目前，房颤的复律治疗可以通过填充心肌的可兴奋间隙来恢复窦性心律，并阻止心律失常的传播。可兴奋间隙是指上一个异位起搏点引起的去极化心肌组织和下一个异常电信号引起去极化的心肌组织之间的可兴奋但未兴奋的心肌组织。可兴奋间隙也可以通过增加心脏波长来减小，而心脏波长是传导速度和动作电位持续时间（APD）的乘积。通过延长APD持续时间的光遗传学操作可以实现填充可兴奋间隙，从而终止房颤发作。心脏电复律通过一定强度的电击，导致大量心肌细胞除极，并延长随后的动作电位，从而使心肌细胞对下一个心律失常无反应。但是，电复律存在若干个缺点：①电流诱导的去极化电流是广泛且瞬时的；②治疗过程需要使用镇静剂来减轻患者的痛苦，增加了电复律的局限性；③除颤波对心肌细胞膜电位有不均匀影响，增加了超极化细胞的数量，导致心肌细胞之间出现电位梯度，从而引发心律失常再次形成。相比于电除颤，光遗传学技术可以产生连续、无痛的去极化电流，且不会破坏心肌和周围组织。因此，我们有理由认为光遗传学技术为房颤的复律治疗提供了一种全新的选择。我们将从离体实验、在体实验以及计算机模拟实验三个方面阐述光遗传学技术在终止房颤发作中的研究进展。

2.1 光遗传学技术在离体实验中终止房颤发作在离体实验，最开始由BINGEN等［20］将CatCh表达在新生大鼠心肌细胞单层，通过突发电起搏以诱导围绕功能核心旋转的螺旋波，并利用多电极阵列MEA研究CatCh激活对折返回路的影响。该研究团队首先用10 ms脉冲的470 nm蓝光照射心肌细胞，结果仅在表达CatCh的心肌细胞单层中激发了动作电位，随后将光脉冲延长至500 ms，发现在31个表达了CatCh的单层心肌细胞中折返回路全部被终止，而没有表达CatCh的心肌细胞单层中折返回路对光照无反应；这提示心肌细胞单层中的螺旋波可被光诱导的去极化电流终止，为非电击除颤提供了概念验证。之后NUSSINOVITCH等［21］将光敏感的超极化质子泵ArchT表达在人胚胎肾细胞293（HEK293）上，随后将ArchT-HEK293细胞与新生大鼠心肌细胞（NRCMs）或人胚胎干细胞源性心肌细胞（hESC-CMs）共同培养形成串联细胞单元，之后应用多电极阵列MEA记录聚焦的590 nm黄光照射细胞之前、期间、之后的传导和变时特性；结果显示光照之后NRCMs的电活动完全被沉默，导致大鼠心肌细胞中局部传导阻滞的发展；在光照下的hESC-CMs自发搏动显著减慢，由光照前的（86 ± 9）次/分降低至光照后的（20 ± 4 ）次/分，证明超极化视蛋白被激活能稳定膜电位，消除心律失常的传播，在离体心肌细胞中可有效终止房颤。

2.2 光遗传学技术在在体实验中终止房颤发作BRUEGMAN等［22］将表达ChR2（H134R）的转基因小鼠与房颤易感的连接蛋白40杂合突变（Cx40 Ala96Ser）小鼠进行杂交，以此构建出新的光遗传学房颤易感的小鼠品系；将该品系小鼠心脏取出，灌注低钾泰氏液体和KATP通道激活剂以诱发持续性房颤，随后通过聚焦蓝光（470 nm，0.4 mW/mm2）照射心外膜；结果显示，相较于不表达光敏感蛋白的对照组小鼠，光遗传学房颤易感的小鼠离体心脏经过光照后房颤被有效终止。当光遗传学技术被证实在离体实验中可以用于终止房颤发作之后，BRUEGMANN等［22］开始研究在体实验中的光遗传学技术复律治疗，他们用携带ChR2的腺相关病毒来转染小鼠的心脏，6 ～ 8个月后将小鼠麻醉后开胸，用静脉刺激导管在心内膜处予以Burst刺激，以诱发小鼠房颤发作，随后用心外膜照射的方式观察房颤的终止情况，结果显示在首测的7只小鼠中有6只能通过光照终止房颤。同样，近期发表的一项研究通过重组腺相关病毒［rAAV9-CAG-hChR2（XXM）-eYFP］转染SD大鼠心肌细胞，通过Burst刺激（6 V、20 ms、2 ～ 4 s）诱发房颤后，对心房施加4个间隔1 s的光脉冲，观察光照能否有效终止房颤；结果显示，光照后大鼠房颤终止率明显升高，房颤的持续时间也明显缩短，证明光照能有效地在体内终止房颤的进展［23］。以上两项研究证明，光遗传学技术可以有效终止在体小鼠、大鼠的房颤发作。

2.3 光遗传学技术在计算机模拟实验中终止房颤发作 为研究光遗传学的转化潜力，BOYLE等［24］选择了3例房扑伴纤维化患者，创建了由晚期Gd增强MRI扫描重建的特定患者模型，并模拟了ChR2表达，随后对每个模型分别采用分散式照明和定向照明；结果发现，分布式照明的房性心动过速（AT）终止率很低，AT终止率从短脉冲（1 ～ 10 ms）的不足5%到长脉冲（100 ～ 1 000 ms）的20%左右；但是当实验人员尝试使用定向照明终止相同的AT发作时，短脉冲的结果相似（AT终止率0%），但是长脉冲的结果明显有所改善（AT终止率为54% ～ 90%）。因此，计算机模拟实验有效地证明，持续时间长于房速周期长度的光脉冲可以有效终止房颤发作，这也为光遗传学技术复律治疗的临床转化提供了依据。

综上所述，心脏光遗传学技术是一种有潜力的房颤复律治疗手段，特别是在年轻、症状明显、药物耐受和心力衰竭患者中，光遗传学技术可能会使患者受益。但是，在考虑将这一项技术用于临床之前，有几个挑战需要解决，比如光敏感蛋白的选择、光敏感蛋白的传递策略和载体选择，以及人体对载体和光敏感蛋白的免疫反应等［25］。理想化载体的发现以及将光信号无创、有效地传递给靶细胞是目前光遗传学转化研究的重点难题。病毒是目前最常用的基因载体，腺相关病毒（AAV）是基础研究和临床试验中最广泛使用的病毒工具之一。AAV为野生型病毒，虽然没有致毒潜力，但是我们仍需要考虑到病毒的免疫原性［26］。由于AAV在人类中普遍存在，大多数的患者携带AAV抗体，因此开发一个不引起免疫反应或者轻度免疫反应的病毒株或血清型是有必要的［27］。另外，一些非病毒载体的研发也为光遗传学技术转化研究提供了一丝曙光，但是其不良反应仍然没有太多文献报导。有效的光信号传递是光遗传学技术临床应用的另一大挑战。在传统的心脏光遗传学基础研究中，通常采用心包外的可见光照射，而心内膜光信号传导仍然未得到有效解决。同样，在跳动的心脏中提供适当的照明也是相当困难的，目前虽然可以通过植入微型LED装置来解决这一难题，但是其长期适用性仍有待考证。此外，光照产生的热量会导致心脏产生程度不一的化学损伤和热损伤，化学损伤可通过产生黄素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和黑色素而引发［28］；热损伤的产生可能会导致不可逆的细胞损伤，并引发新的心律失常［29］。另外值得注意的是，目前大多数研究是关于心肌细胞单层和计算机模拟实验的，在活体心脏中的研究相对较少。因此，还需要更多的试验来确定心脏光遗传学技术在人体内的安全性，以及光遗传学技术在人体应用的具体光学参数。虽然目前报道显示机体对载体和视蛋白的免疫反应很小，但是仍然需要足够多的试验数据来保证光遗传学技术的安全性和可行性。光遗传学使得基础研究科学家和临床医生能够精确地操纵细胞电活动，未来在心脏电生理领域中的研究重点是在人体中安全有效地调控心脏电活动。然而实现这一目的仍然还有很长的路要走，考虑到以上难题，光遗传学技术的临床转化研究还需要经过长时间的实践探索。