贵定县某养鹅场雏鹅死亡病例诊断

张美兰，冉崇波，杜小敏

贵定县养殖业发展中心，贵州贵定 551300

随着畜牧业大力发展，各种鹅类传染病流行情况越来越复杂，发病率也不断升高，其中大肠杆菌病、沙门氏菌病和葡萄球菌病等为近年来雏鹅常见的传染病[1,2]。贵定县鹅场饲养的4 日龄鹅苗中，部分出现精神沉郁、神态恍惚、机体消瘦、羽毛污浊、食欲减少或废绝、饮水增多、肛门周围及后躯被粪便污染、拉白痢等症状。养殖户凭以往经验最开始采用青霉素治疗，但患病雏鹅病情不见好转，反而持续恶化。

1 实验材料

1.1 实验动物

贵定县某鹅场患病雏鹅相关病料。

1.2 实验主要试剂与仪器

试剂：草酸铵结晶紫，蒸馏水，碘液，乙醇，番红，Marker，MIX，PBS，模板，引物，LB 液体培养基，TBE、1.2%琼脂糖凝胶。

仪器：PCR 自动扩增仪（TC-412），超净工作台（SW-CJ-2D），恒温摇床，自动双重纯水整流器（SZ-93 型），DYY-10 型（ECP3000）三恒电泳仪；SYGENE 凝胶成像仪。

2 实验方法

2.1 临床症状与病理变化观察

对患病雏鹅进行临床症状观察，将雏鹅呈仰卧式固定在解剖台上，依次检查内部各个器官的病理变化。

2.2 细菌分离鉴定

2.2.1 细菌分离培养与纯培养

用接种环蘸取少许病料，在琼脂表面进行来回划线，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h 后观察。然后接种于普通琼脂平板、鲜血琼脂平板和麦康凯平板上进行纯化培养。

2.2.2 细菌染色镜检

涂片、干燥、固定、革兰氏染色、镜检后详细观察。

2.2.3 生化试验

将微量生化反应管内液体摇晃均匀后撇成两段，用接种环挑取纯化后的细菌接种到有字体标识的反应管内，另一只作为对照组，做好标记依次排列在凹孔泡沫板上，37 ℃恒温培养箱培养24 h。

2.2.4 PCR 鉴定

2.2.4.1 16S rRNA 基因序列分析

由贵州大学动物疫病研究室提供细菌通用引物序列，上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；下游引物1492R ：5'-TACGGTTACCTTGTTACGA CTT -3'。

利用16S rRNA 通用引物对分离培养得到的菌株进行扩增和测序，将分离菌株命名为GD。试验采用50 µL 体系。上、下游引物分别为2.5/µL，MIX 25/µL，模板5/µL，超纯水15/µL。反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，52 ℃退火为1 min，72 ℃延伸2 min，共30 个循环，72 ℃终延伸5 min,最后4 ℃保存。

2.2.4.2 特异性引物PCR 扩增

挑取单个菌落，接种LB 液体培养基，作好标记放置37 ℃摇床培养12 h，取菌液用贵州大学动物疫病研究室提供的大肠杆菌特异性引物上游引物F:5'-GCAAACAGGATTAGATACCC-3'；下游引物R:5'-CAGCCATGCAGCACCTGTCTCAC-3'进行PCR 扩增，试验采用50 µL 体系。上游引物2.5/µL，下游引物2.5/µL，MIX 25/µL，模板5/µL，超纯水15/µL。反应程序：95 ℃预变性2 min，94 ℃变性40 s，57 ℃时退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 个循环，72 ℃终延伸7 min，最后4 ℃保存。

PCR 扩增期间，用锥形瓶配置1.2%琼脂糖溶液，微波炉加热至透明，摇匀后倒入电泳板中静置约20 min，冷却后把琼脂糖块放入电泳槽中，倒入适量的1×TBE 缓冲液，分别取10 µL D2000Marke 和PCR 产物用于加样，进行电泳35 min 后，取出琼脂糖凝胶，放置于电泳凝胶图像分析系统中成像。

2.2.5 药敏试验

用镊子夹取药敏纸片平放于琼脂平板表面，轻压贴紧，做好标记，于37 ℃恒温箱培育24 h，取出观察测定药物的抑菌大小。

3 实验结果与分析

3.1 临床症状与病理观察

患病雏鹅机体瘦弱，精神萎靡，食欲衰退，呼吸障碍，目肿流泪，双腿软弱无力，羽毛松乱污浊，脱水，排白色或绿色粪便，排泄物中混有未消化的饲料，肛门周围羽毛被粪水污染，干涸后阻碍排粪。通过解剖观察发病雏鹅，肝脏肿大，变黄，出血；脏器表面有淡黄色的纤维素性渗出物；肠内容物堆积，肠内产气。

3.2 细菌分离鉴定

观察到普通琼脂平板和鲜血琼脂平板上皆有菌落生长，呈乳白色、扁平、光滑、圆润、边缘整齐的中小菌落，在麦康凯琼脂平板上长出粉红色菌落；染色镜检为两端钝圆、中等大小的革兰氏阴性杆菌。

3.3 生化试验

分离菌株能发酵葡萄糖产酸产气，发酵棉子糖、山梨醇、木糖试验为阳性。

3.4 PCR 鉴定

3.4.1 16S rRNA 基因序列分析

凝胶电泳结果与预期的扩增产物片段1 451 bp大小一致。将PCR 产物切胶回收后测序，测序之后拼接得到有效完整序列,将其命名为GD。而后与NCBI 上其他参考株16S rDNA 基因进行序列相似性分析和系统发育树的构建，结果显示GD 菌株与大肠杆菌的NR_114042 序列的score 值为2433，相似度97.63%，同源性较好，根据得到的系统发育树的拓扑结构以及Bootstrap 值可以看出，GD 菌株与大肠杆菌菌株的亲缘关系最近，菌株GD 应同属于大肠杆菌。

3.4.2 特异性引物PCR 扩增

特异性引物PCR 扩增结果与预期的扩增产物片段275 bp 大小一致。

3.5 药敏试验

所测药物中，对丁胺卡那和米诺环素高度敏感，对氧氟沙星、环丙沙星和多西环素中度敏感，新霉素、庆大霉素、四环素和头孢唑林等不敏感。

4 讨论

鹅大肠杆菌病是由条件致病性大肠埃希氏杆菌引起的局部或全身发病的细菌性传染性疾病，包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌性肉芽肿、气囊炎和肝周炎等一系列疾病[3，4]。这些疾病可独立发生，也可混合感染或继发其它疾病共同流行[5]。饲养管理、营养条件、应激等因素都可诱发该病的发生，且发病急，发病率较高，常发生在春冬和秋末季节，是危害养鹅业的主要细菌性传染病之一[6,7]。该病的主要传播源是患病雏鹅和带菌雏鹅；传播途径主要为呼吸道、消化道、交配等感染[8]；发病原因多为鹅舍环境卫生差、空气污浊灰尘多、不重视消毒预防等[9]。应加强饲养管理、保持干净卫生饲养环境、做好免疫接种，有效预防该病流行[10，11]。

5 结论

5.1 观察患病雏鹅的临床症状与病理变化，并进行细菌分离鉴定、16 SrRNA 基因扩增和特异性PCR 扩增，诊断结果为大肠杆菌感染所致。

5.2 由药敏试验得知，对该鹅场可选用丁胺卡那、米诺环素、氧氟沙星、环丙沙星等进行预防治疗。