基于GC-MS/MS联合HPLC-MS/MS测定大枣禁用农药残留

吴禄祥 黄若干 周劲松 刘春荣 蓝晓东 钟林静

摘 要：目的：建立QuEChERS结合气相色谱-串联质谱法（Gas Chromatography-tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）联合高效液相色谱-串联质谱法（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）检测大枣禁用农药残留的方法。方法：样品以体积比为1%的乙酸乙腈为溶剂，高速匀浆，采用QuEChERS法净化处理样品，分别以气质法和液质法进行分析，气质法采用外标法定量，液质法采用内标法定量。结果：气相色谱-串联质谱法检测的35种农药线性关系良好，相关系数均≥0.997 2，定量限为0.000 1～0.005 5 mg·kg-1，回收率为65.54%～101.03%，相对标准偏差为0.38%～11.54%。高效液相色谱-串联质谱法测定的30种农药线性关系良好，相关系数均≥0.989 6，定量限为0～0.000 49 mg·kg-1，回收率为62.92%～109.96%，相对标准偏差为0.04%～3.71%。结论：该方法操作简便、高效、定量定性准确、灵敏度高、重现性和稳定性良好，适用于大枣禁用农药残留的快速检测。

关键词：大枣；气相色谱法-串联质谱法；高效液相色谱-串联质谱法；QuEChERS；禁用农药残留

Abstract： Objective： The method of QuEChERS combined with gas chromatography-tandem mass spectrometry（GC-MS/MS） and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS） for the determination of forbidden pesticide residues in jujube was established. Method： The samples were purified by QuEChERS method using acetonitrile with 1% volume ratio as solvent and homogenized at high speed. The samples were analyzed by temperament method and liquid mass method respectively. The temperament method was quantified by external standard method， and the liquid mass method was quantified by internal standard method. Result： The linear relationship of 35 pesticides detected by gas chromatography-tandem mass spectrometry was good. The correlation coefficients were all greater than 0.997 2， the limits of quantitation were 0.000 1～0.005 5 mg·kg-1， the recoveries were 65.54%～101.03%， and the relative standard deviations were 0.38%～11.54%. The 30 pesticides determined by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry have good linear relationships. The correlation coefficients were all greater than 0.989 6， the limits of quantification were 0～0.000 49 mg·kg-1， the recoveries were 62.92%～109.96%， and the relative standard deviations were 0.04%～3.71%. Conclusion： This method is simple and efficient， with accurate quantitative and qualitative analysis， high sensitivity， good reproducibility and stability， and is suitable for the rapid detection of prohibited pesticide residues in jujube medicinal materials.

Keywords： jujube; gas chromatography-tandem mass spectrometry; high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry; QuEChERS; prohibited pesticide residues

大枣（Ziziphus jujuba Mill.）属于鼠李科植物枣的干燥成熟果实[1]，有养胃、健脾、益血等效果，属安神类中药[2]，被广泛应用于临床、中药制剂、大健康产品的开发。现代药理研究证明，大枣含黄酮、生物碱、三萜类和多糖类等化合物，具有降压、镇静催眠、抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、补血、增强心肌收缩力和减轻疲劳等作用[3]。大枣极易遭受病虫害，种植户滥用农药导致农药残留超标已成为影响大枣质量和安全的重要因素。农药残留会导致人体多种疾病，如引发心肌炎[4]，危害神经系统，甚至有致癌、致畸、致突变等危害[5]，导致女性患乳腺癌、子宫癌的风险增加[6]，已经成为不容忽视的问题[7]，引起普遍关注。中国药典2020年版收录了中药材及饮片（植物类）33种禁用农药，农药残留检测方法气相色谱法[8]和气相色谱-串联质谱法[9]，中国药典“第五法药材及饮片（植物类）中禁用农药多残留测定法”[10]規定了中药材及饮片的禁用农药残留测定方法为气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-串联质谱法。大枣作为藿香正气颗粒的主要原料，常有农药残留超标的情况发生。为保证用药安全，广西白云山盈康药业有限公司特别关注了原料大枣的质量和农药残留问题，通过建立QuEChERS结合气相色谱-串联质谱法（Gas Chromatography-tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）联合高效液相色谱-串联质谱法（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS），以中国药典2020年版农药残留分析方法为依据，对大枣中禁用农药残留进行了研究，可为中药禁限用农药监管和检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

冰醋酸（优级纯，20200427-001）、甲酸（AR，20200710-001），购自天津科密欧化学试剂有限公司；提取盐（60105-335-B），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；分散固相萃取净化管（6015-509-B），北京迪科马科技有限公司；甲酸铵（色谱纯）、异丙醇（色谱纯，L6750432-004）、乙腈（色谱纯，M1881440-041）、甲醇（色谱纯，06751440-019），中山联思化科技有限公司；磷酸三苯酯（CDAA-S-412134-JD-1 mL）、55种禁用农药混合对照品溶液（CDAA-M-490407-TY-1.2 mL），上海安谱实验科技股份有限公司。委托合格供应商收集山西、新疆、河北、甘肃、山东和福建等10批不同产地的大枣。

1.2 试验方法

1.2.1 制备对照溶液

（1）制备混合对照溶液。精密量取250 μL禁用农药混合对照溶液，置于量瓶中，加乙腈配制中间储备液；精密量取中间储备液2 mL，置于量瓶中，加乙腈到规定量，摇匀，制备工作溶液。

（2）制备GC-MS/MS法分析用内标溶液。精密取磷酸三苯酯对照品适量，制成0.1 mg·L-1的分析用内标溶液磷酸三苯酯。

（3）制备空白基质溶液。照供试溶液制备方法，取空白基质样品适量，制成空白基质溶液。

（4）基质混合对照溶液的制备。精密吸取6份空白基质溶液各1.0 mL，40 ℃氮吹浓缩至约0.4 mL，分别加工作溶液l0 μL、20 μL、50 μL、l00 μL、150 μL和200 μL，加乙腈定容至l mL，涡旋混匀，即得。

1.2.2 制备供试溶液

取供试适量，剪切成块再研磨成粉，取粉末3 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加1%冰醋酸溶液15 mL，涡旋后静置30 min，加乙腈15 mL，涡旋5 min，加质量比为4∶1的无水硫酸镁与无水乙酸钠混合粉末7.5 g，加入粉末后立即摇散，并振荡器剧烈振荡3 min，置冰浴冷却10 min，以4 000 r·min-1的转速离心5 min，再取上清液9 mL，置于已装有净化材料（无水硫酸镁900 mg、N-丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷键合硅胶300 mg、硅胶300 mg、石墨化碳黑90 mg）的分散固相萃取净化管，以4 000 r·min-1的转速涡旋振荡5 min，使净化完全，精密取上清液5 mL，置水浴吹氮仪上40 ℃蒸至约0.4 mL，加乙腈至1.0 mL，涡旋混匀，取0.5 mL于10 mL离心管中，加入150 μL内标涡旋混匀，0.22 μm有机滤膜滤过，精密量取0.5 mL样液，置于10 mL离心管中，加入150 μL一级水，涡旋混匀，0.22 μm有机滤膜滤过。

1.2.3 GC-MS/MS法

（1）色谱条件。50%苯基-甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。温度250 ℃，不分流进样。载气高纯氦气（He），柱前压力146 kPa，恒压模式。升温程序：初温60 ℃，保持1 min，30 ℃·min-1升至120 ℃，10 ℃·min-1升至160 ℃，2 ℃·min-1升至230 ℃，15 ℃·min-1升至300 ℃，保持6 min。

（2）质谱条件。采用三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为EI；温度250 ℃；碰撞气为氮气或氩气；质谱传输接口的温度为250 ℃；质谱监测模式为多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

1.2.4 HPLC-MS/MS法

（1）色谱条件。色谱柱（10 cm×2.1 mm，2.6 μm）以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A：0.1%甲酸溶液（含5 mmol·L-1甲酸铵），流动相B：乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol·L-1甲酸铵）体积比95∶5，按表1所示时间和流动相比例梯度洗脱，柱温40 ℃，流速0.3 mL·min-1。

（2）质谱条件。采用三重四极杆串联质谱仪检测；ESI离子源；MRM监测模式；正离子扫描模式。

1.2.5 测定方法

（1）GC-MS/MS法。分别精密吸取基质混合对照液、供试液各0.5 mL，置于10 mL离心管中，精密加入150 μL内标溶液，混匀，0.22 μm有机滤膜过滤，精密取过滤后的基质混合对照液、供试液两种溶液各1 μL，注入气相色谱-串联质谱仪，按外标标准曲线法计算。

（2）HPLC-MS/MS法。分别精密取基质混合对照液、供试品液各0.5 mL，置于10 mL离心管中，精密加入150 μL纯水，混匀，0.22 μm有机滤膜过滤，精密取过滤后的基质混合对照液、供试液两种溶液各2 μL，注入高效液相色谱-串联质谱仪，按内标标准曲线法计算。

2 结果与分析

2.1 气相色谱-串联质谱检测及液相色谱-串联质谱检测

将一定浓度的混合对照品溶液分别注入液相色谱串联质谱仪和气相色谱串联质谱仪，在MRM模式下，對关键参数进行优化，并确定分析条件的最佳参数，获得总离子流图，见图1、图2。

2.2 标准曲线线性及定量限验证

实验结果表明，气相色谱-串联质谱法检测的35种农药线性关系良好，相关系数均≥0.997 2，定量限为0.000 1～0.005 5 mg·kg-1，说明各禁用农药成分的气质曲线线性良好，信噪比均大于10且定量限达到要求，见表2；高效液相色谱-串联质谱法测定的30种农药相关系数均≥0.989 6，线性关系良好，定量限为0～0.000 49 mg·kg-1，说明液质曲线线性良好，信噪比均大于10，定量限达到要求，见表3。

2.3 准确度检验

称取约5 g不含目标物的供试品9份，分低、中、高3组，每组3份，低、中、高组分别加中间储备溶液30 μL、60 μL、90 μL，依照供试品液制备方法检测，计算回收率和相对标准偏差。35种禁用农药的气相色谱-串联质谱法回收率为65.54%～101.03%，相对标准偏差为0.38%～11.54%，高效液相色谱-串联质谱法回收率为62.92%～109.96%，相对标准偏差为0.04%～3.71%。实验回收率均在60.00%～130.00%，相对标准偏差均低于15%，说明本方法准确性、精密度良好，满足农药残留检测要求。

2.4 稳定性试验

精密称定样品1份，加入1.2.1步骤（1）下的中间储备溶液30 μL，按照供试液制备方法制备供试液，室温放置，在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h取样测定，计算相对标准偏差。气相色谱-串联质谱法和高效液相色谱-串联质谱法各个时间化合物检出浓度的相对标准偏差均小于15%，说明加标后样品溶液室温条件下24 h内稳定。

3 结论与讨论

本研究利用气相色谱-串联质谱法和高效液相色谱-串联质谱法对10批来自不同产地的大枣进行禁用农药残留检测分析，该方法稳定性较好，适合大枣的农药残留检测。不同产地的10批大枣均未检出禁用农药残留，质量达标。

目前，国内尚未有关大枣禁用农药残留检测标准的文献报道，本研究建立了气相色谱-串联质谱法联合高效液相色谱-串联质谱法测定大枣禁用农药残留的方法，通过添加内标和建立基质匹配标准曲线消除基质效应，避免样品出现假阴性。本研究通过在高效液相色谱-串联质谱中，采用基质匹配标准曲线，降低基质效应的影响；在气相色谱-串联质谱中，通过添加内标物质磷酸三苯酯，降低基质效应的影响，从而解决质谱检测结果普遍存在基质效应的难题。农药残留检测常用提取溶剂为石油醚、醋酸乙酯、乙腈、正己烷和丙酮等[11-13]。为减少基质效应的干扰，多以乙腈提取，QuEChERS净化，以提高目标物的富集程度和检测灵敏度[14-15]。本研究采用1%乙酸浸制30 min，再加入乙腈提取，保护了对酸碱敏感的农药成分，提高了稳定性。随着科学技术的进步和检验技术的不断提高，越来越多的标准将采用气质联用和液质联用作为主要的农药残留分析手段，本研究对农作物规范化、标准化种植起到积极的推动作用。

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