王敬,孟珂,陈璇,章家恩,2,3,4*,向慧敏,2,3,4,钟嘉文,石兆基
1. 华南农业大学资源环境学院,广东 广州 510642;2. 广东省生态循环农业重点实验室,广东 广州 510642;3. 广东省现代生态农业与循环农业工程技术研究中心,广东 广州 510642;4. 农业农村部华南热带农业环境重点实验室,广东 广州 510642
酸雨是由大气污染引起的pH 值小于5.6 的降水(冯宗炜,2000),已成为全球性的生态环境问题之一。中国酸雨频频出现,目前主要分布于中国长江以南和云南-贵州以东地区(任晓巧等,2021),危害农作物的产量和营养品质及其健康生产(李建鑫等,2021)。大量研究表明,酸雨会对植物的叶片造成直接或间接的伤害(Sun et al.,2016)。如酸雨可直接危害叶片表面结构,如长斑、黄化和坏死、卷曲等(Ahmad et al.,2021;Pham et al.,2022),降低叶绿素含量(陈文胜等,2019),抑制植物生长、光合能力和叶绿体结构完整性(Li et al.,2022),损伤植物叶片的微结构(Andrade et al.,2020),降低改变植物的膜透性,影响叶片的抗氧化系统,造成植物的氧化损伤,抑制植物的生长发育,从而降低农作物的产量及营养品质(Zhang et al.,2022)。有关研究表明,不同pH 酸雨对植物产生不同程度的影响,在强酸性酸雨胁迫下,生长受到抑制,脯氨酸、可溶性蛋白(水德聚等,2016)、可溶糖(王菊等,2013)和维生素C的含量下降(王双明,2012)。同时,酸雨会直接或间接影响植物的生理功能(Debnath et al.,2021),尤其是植物的光合作用以及在此期间释放的叶绿素荧光。近年来国内外有关于酸雨对植物生长发育及生理生化影响的研究较多(Sun et al.,2016),但酸雨胁迫对蔬菜光合作用、产量及营养品质的研究较少。
蔬菜对人类的饮食至关重要,提供了人体所需的多种维生素、矿物质和膳食纤维等营养物质,以维持正常的生理功能(Javid et al.,2018),也可预防微量营养素缺乏(即“隐性饥饿”)和非传染性疾病,降低多种癌症的发病率(张璐等,2021)。当酸雨发生时首先接触的是植物叶片,叶片作为叶菜类作物的主要食用部位,酸雨的频发会对其造成明显影响(Hu et al.,2014),威胁叶菜类作物的生长、外观及营养品质。生菜(Lactuca sativalL.)和上海青(Brassica chinensisL.)这两种叶菜类作物种植范围广、生长周期短、营养物质丰富,在中国各地广泛栽培。这两种作物品种特征略有不同,生菜为莴苣属,叶厚、叶缘波状、叶面皱缩、心叶略抱合;上海青为芸苔属,叶柄肥厚、叶片光滑、青绿色、株型束腰。因此本研究选择生菜和上海青这两种叶菜类作物作为研究对象,通过盆栽实验研究酸雨对生菜和上海青这两种叶菜类植物的叶绿素荧光、叶绿素含量、产量及营养品质的影响,旨在为评价酸雨对蔬菜作物生产的危害风险提供相关参考。
参照华南地区的酸雨类型,用分析纯H2SO4和HNO3配制摩尔浓度比为n(SO42−):n(NO3−)=2:1的酸雨母液,pH=1。然后,添加自来水进行稀释,逐渐提高pH,用多参数测定仪S210-k 监测pH 变化,分别调节pH 至2.5(超强酸雨)、3.5(强酸雨)、5.0(弱酸雨)的酸性溶液(模拟酸雨处理)。对照为自来水(pH 为7.0)。根据广东省生态环境厅公开发布的《广东省生态环境状况公报》(广东省生态环境厅,2022)确定酸雨喷施量,通过喷壶模拟酸雨。
试验于2022 年4-6 月在华南农业大学农学院内(23°10′01′′N,113°21′55′′E)进行。供试蔬菜为意大利生菜和精品上海青,土壤采自华南农业大学生态学教学实验基地(23°10′13′′N,113°22′28′′E)的赤红壤,其基本理化性质如下:土壤pH 为6.61,有机质质量分数为25.9 g·kg−1,全氮质量分数为1.25 g·kg−1,全磷质量分数为1.58 g·kg−1,全钾质量分数为18.6 g·kg−1,有效磷质量分数为397 mg·kg−1,速效钾质量分数为66.8 mg·kg−1。
在四周开敞的学院实验大楼的连廊上(上有顶廊,长约8 m,宽约7 m)开展盆栽试验,这样可保持盆栽的气候条件与室外环境基本一致,由于放置盆栽实验的廊道上存在顶廊,故盆栽实验不会受到自然降水的影响。设置生菜和上海青各4 个处理,分别为CK(自来水)、pH 5.0、pH 3.5、pH 2.5。开展盆栽试验连廊上的室外环境温度为 18-28 ℃。每个处理8 个重复,两种蔬菜共64 盆。
将自然风干的土壤磨细过2 mm 筛后装入塑料花盆内(高18 cm,直径22 cm),每个花盆装土3 kg,且不施加任何肥料。
4 月1 日起开始进行育苗。选择大小一致、饱满健壮的生菜和上海青种子,催芽浸种后播种在育苗盘中。5 月1 日待幼苗长至3-4 片真叶时,选取生长良好、长势一致的生菜和上海青幼苗各32 棵,分别移入各塑料花盆中,缓苗期间用自来水灌溉。5 月5 日开始模拟酸雨喷淋实验,每3 天用喷壶从作物冠层喷洒一次酸雨,每次喷酸量为100 mL;CK则用100 mL 自来水进行喷淋处理。每7 天随机打乱盆栽的位置重新放置,以保证盆栽生菜和上海青生长过程中所受到的环境条件总体一致。
1.4.1 鲜物质质量的测定
在收获生菜和上海青时,将可食部与根部分离,并用电子天平称量可食部鲜物质质量,即为生菜和上海青的产量。
1.4.2 生理指标的测定
(1)叶绿素荧光参数
5 月10 日开始测定叶绿素荧光,每隔10 天测定1 次,整个生长期共测定4 次。采用Mini-PAMII便携式叶绿素荧光仪(Germany,Walz)测定叶绿素荧光系统参数,在晚上8 点开始测定生菜和上海青叶片的叶绿素荧光指标,测量时选择每棵植株同一部位生长良好且完全展开的叶片(避开中间叶脉)。
(2)叶绿素质量分数
采用丙酮提取法测定叶绿素(章家恩,2007)。即在生菜和上海青收获期(40 d),每个处理组随机取新鲜生菜和上海青叶片组织0.5 g,放入研钵中,加入少量石英砂和碳酸钙粉末及2-3 mL 80%丙酮,在弱光条件下研磨成匀浆;再加入丙酮5 mL,继续研磨至组织变白,转移至25 mL 棕色容量瓶中,用80%丙酮定容、摇匀、离心或过滤;分别于波长663、645、652、440 nm 下测定吸光度(D)值,计算叶绿素a(Ca)、叶绿素b(Cb)、总叶绿素(Ct)以及类胡萝卜素(Ck)的质量分数。
1.4.3 品质指标的测定
在生菜和上海青收获期(40 d),每组随机选取4 株,取植株叶片测定生菜和上海青的营养品质指标。采用考马斯亮蓝G-250 法测定可溶性蛋白质(章家恩,2007);采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性糖(吴青君等,2007);采用酸性茚三酮提取法测定脯氨酸(章家恩,2007);采用香草醛-盐酸法测定植物原花青素(董瑞霞等,2008);采用钼蓝比色法来测定维生素C(李军,2000)。
应用Microsoft Excel 2016 对数据进行初步整理;SPSS 26.0 进行单因素方差分析,并对数据进行正态性和方差齐性以及显著性(P<0.05)检验;Origin 2021作图,统计结果以平均值和标准差表示。
由图1 可知,经40 d 处理后,不同强度酸雨对生菜和上海青的可食部鲜质量产生显著影响。在pH 5.0 酸雨处理下,生菜的鲜质量与对照相比无显著差异(P>0.05),而pH 3.5 和pH 2.5 酸雨处理后与对照相比显著下降了31.3%和41.6%。在pH 5.0 酸雨处理下,上海青的鲜质量与对照相比未达到显著差异,而pH 3.5 和pH 2.5 酸雨处理与对照相比,显著下降了12.2%和27.6%。
图1 不同强度酸雨处理下生菜和上海青产量Figure 1 The fresh weight of lettuce and Brassica chinensis L. under different intensity acid rain treatment
2.2.1 酸雨对生菜和上海青叶片叶绿素荧光参数的影响
经酸雨处理后生菜和上海青叶片叶绿素荧光参数的方差分析见表1,动态变化见图2。
表1 不同蔬菜种类、酸雨强度以及处理时长对生菜和上海青叶绿素荧光参数的三因素方差分析Table 1 Three-factor variance analysis of chlorophyll fluorescence parameters of lettuce and Brassica chinensis L.by different vegetable varieties, acid rain intensity and treatment duration
图2 不同强度酸雨处理下生菜和上海青的各个生长时期叶片的叶绿素荧光参数Figure 2 Chlorophyll fluorescence parameters of lettuce and Brassica chinensis L. leaves at different periods under different intensification of acid rain
图2a 可知,蔬菜种类、酸雨处理和处理时长对生菜和上海青的Fv/Fm(最大光合效率)均有显著影响(P<0.01、P<0.05、P<0.001),而且蔬菜种类和处理时长对Fv/Fm有显著的交互作用影响(P<0.001),蔬菜种类和酸雨处理、酸雨处理和处理时长对Fv/Fm无显著的交互作用(P=0.762、P=0.575),三者对Fv/Fm无显著的交互作用(P=0.071)。在酸雨处理生菜的第10 天,pH 3.5 和pH 2.5 处理与对照相比分别显著下降了7.64%和12.3%;在酸雨处理上海青的第20 天,pH 2.5 酸雨处理与对照相比显著下降了8.23%(P<0.05),其余处理与对照相比无显著性差异。第10 天时生菜的Fv/Fm值显著低于上海青。
图2b 可知,蔬菜种类、酸雨处理和处理时长对生菜和上海青的YII(实际光能转换效率)值均有显著影响(P<0.001、P<0.01、P<0.001),蔬菜种类和处理时长对 YII 有显著的交互作用影响(P<0.001),蔬菜种类和酸雨pH、酸雨pH 和处理时长对YII 无显著影响(P=0.113、P=0.596),三者对YII 有显著的交互作用影响(P=0.002)。不同酸雨处理下,两种叶菜类植物YII 值变化趋势不同,生菜的YII 随着酸雨酸度的升高而降低,不同时期的生菜在强酸性酸雨(pH 2.5)处理下显著下降,与对照相比分别下降14.8%、10.5%、16.8%、15.9%。上海青的不同生长时期YII 值在弱酸性酸雨(pH 5.0)处理下升高,随着酸雨酸度的升高,YII 值下降,在pH 2.5 酸雨处理下的第20、30、40 天,与对照相比,分别显著下降21.3%、8.16%、12.3%。
图2c 可知,蔬菜种类和处理时长对生菜和上海青的 NPQ(非光化学淬灭)有显著影响(P<0.001),酸雨处理对 NPQ 无显著影响(P=0.105),蔬菜种类和酸雨处理、蔬菜种类和处理时长对NPQ 有显著的交互作用影响(P<0.05),酸雨处理和处理时长以及三者对NPQ 无显著的交互作用影响(P=0.566、P=0.059)。生菜NPQ 在第10、20、30 天随着酸雨酸度的升高而降低,但差异不显著(P>0.05),第40 天酸雨处理组低于对照组,在pH 3.5 和pH 2.5 处理下显著降低,分别下降了21.4%和25.3%;上海青NPQ 在不同酸度酸雨处理第10、20 天与对照之间差异不显著,在第30、40天时,pH 2.5 酸雨处理与对照相比显著降低了19.1%和15.6%,说明随着处理时间的推移,高酸度酸雨对NPQ 产生了显著影响。
图2d 可知,蔬菜种类和处理时长对生菜和上海青的qL(光化学淬灭)均有显著影响(P<0.001),酸雨pH 对qL 无显著影响(P=0.097),蔬菜种类和处理时长对qL 有显著的交互作用影响(P<0.05),蔬菜种类和酸雨处理、酸雨处理和处理时长对qL 无显著影响(P=0.145、P=0.442),三者对qL 存在显著的交互作用影响(P<0.05)。不同强度酸雨处理下,生菜的qL 在前20 天随着酸雨处理酸度的升高呈现先升高后下降的趋势,后20 天酸雨处理组低于对照组,且在pH 2.5 酸雨处理时达到最低值,两种蔬菜分别下降了21.1%和28.4%。上海青的qL 在酸雨处理的第10 天呈现先升高后下降的趋势,在第20、30、40 天酸雨处理低于对照,且在上海青的生长期内,在pH 2.5 酸雨处理下均达到最低值,分别降低了18.1%、13.6%、14.9%和11.7%。
2.2.2 酸雨对生菜和上海青叶片叶绿素质量分数的影响
由表2 可知,蔬菜种类和酸雨处理对生菜和上海青叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素质量分数均有显著影响(P<0.05),蔬菜种类和酸雨处理的交互作用对叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素质量分数有显著影响(P<0.01),对类胡萝卜素质量分数无显著影响(P=0.573)。由图3a-d 可知,经过不同酸雨处理40 d 后,生菜的叶绿素和类胡萝卜素质量分数均比上海青低。上海青的叶绿素和类胡萝卜素质量分数受酸雨胁迫后与生菜变化规律不同,随着酸雨酸度的升高表现出先升高后下降趋势,二者的叶绿素质量分数在pH 2.5 酸雨处理时达到最低值,与对照相比,其叶绿素a 质量分数分别显著下降了30.2%和15.4%;叶绿素b 质量分数分别显著下降了31.6%和11.0%;总叶绿素质量分数分别显著下降了30.5%和8.40%。不同pH 酸雨处理后,两种叶菜类植物的类胡萝卜素质量分数与对照相比无显著差异。
表2 不同蔬菜品种和酸雨强度对生菜和上海青光合色素的双因素方差分析Table 2 Two-factor variance analysis of photosynthetic pigments of lettuce and Brassica chinensis L. under different vegetable varieties and acid rain intensity
图3 不同强度酸雨处理下生菜和上海青光合色素质量分数Figure 3 Photosynthetic pigment contents of lettuce and Brassica chinensis L. under different intensity acid rain treatment
2.3.1 对叶片可溶性蛋白质质量分数的影响
由表3 可知,蔬菜种类对生菜和上海青的可溶性蛋白质质量分数有显著性影响(P<0.001),酸雨酸度对生菜和上海青的可溶性蛋白质质量分数无显著影响(P=0.087),蔬菜种类和酸雨处理对可溶性蛋白质质量分数无显著的交互作用影响(P=0.155)。由下图4a 可知,相同酸度酸雨处理下,上海青的可溶性蛋白质质量分数显著高于生菜。不同酸度酸雨处理下,生菜的可溶性蛋白质质量分数差异不显著,与对照相比,pH 5.0 酸雨处理使生菜和上海青的可溶性蛋白质质量分数分别上升11.0%和3.21%。但在pH 3.5 和pH 2.5 酸雨处理下,与对照相比,生菜的可溶性蛋白质质量分数分别下降了2.03%和3.68%,上海青的可溶性蛋白质质量分数分别显著下降了11.9%和11.8%。
表3 蔬菜品种和酸雨处理对生菜和上海青营养品质的双因素方差分析Table 3 Two-factor variance analysis of vegetable varieties and acid rain treatment on the nutritional quality of lettuce and Brassica chinensis L.
图4 不同酸雨强度处理下生菜和上海青营养物质的质量分数Figure 4 Content of nutrients in lettuce and Brassica chinensis L. under different intensity acid rain treatment
2.3.2 对叶片游离脯氨酸质量分数的影响
蔬菜种类和酸雨处理以及二者的交互作用对生菜和上海青的游离脯氨酸质量分数有显著影响(P<0.001)。由图4b 可知,生菜和上海青的游离脯氨酸质量分数随着酸雨酸度的增强呈现先增加后减小的趋势,且均在pH 5.0 酸雨处理下达到最高,与对照相比分别增加了10.1%和8.58%。在pH 2.5酸雨处理下,生菜和上海青的游离脯氨酸质量分数降低最多,分别比对照显著降低17.5%和15.2%;其次是pH 3.5 酸雨处理,分别比对照降低了10.6%和11.9%,也达到显著差异。
2.3.3 对叶片可溶性糖质量分数的影响
蔬菜种类和酸雨处理以及二者的交互作用对生菜和上海青的可溶性糖质量分数均有显著影响(P<0.001)。由图4c 可知,随着酸雨pH 的降低,生菜和上海青的可溶性糖质量分数与对照相比均呈现先升高后降低的变化,且在pH 2.5 酸雨处理下最低。在pH 5.0 酸雨处理下,生菜和上海青的可溶糖质量分数比对照分别升高了38.2%和4.53%;pH 2.5 酸雨处理比对照分别降低了11.0%和22.7%。
2.3.4 对叶片原花青素质量分数的影响
蔬菜种类和酸雨处理以及二者的交互作用对生菜和上海青的原花青素有显著影响(P<0.001)。由图4d 可知,生菜的原花青素质量分数高于上海青,酸雨处理后生菜和上海青的原花青素质量分数与CK 相比降低且达到显著差异,且在pH 5.0(弱酸)酸雨处理下降低最多,分别减少了30.1%和16.1%。
2.3.5 对叶片还原性抗坏血酸质量分数的影响
蔬菜种类和酸雨处理以及二者的交互作用对生菜和上海青的还原性抗坏血酸质量分数有显著影响(P<0.001)。不同酸度酸雨胁迫下,生菜和上海青的叶片中 ASA 质量分数如下图4e 所示,在pH 5.0 酸雨处理时,生菜和上海青所含ASA 显著上升(P<0.05),与对照相比分别上升了35.9%和13.2%。随着酸雨酸度的增强,ASA 质量分数下降,在pH 2.5 酸雨处理下降低最多,分别下降了16.1%和16.6%。
叶绿体是植物细胞面对环境胁迫时最敏感的细胞器,是植物光合作用的场所。叶绿素是监测植物健康的关键因素(Pham et al.,2022),是植物进行光合作用的重要物质(钟嘉文等,2021)。相关研究结果表明,酸雨会降低植物叶片的叶绿素含量,且随着酸雨pH 降低,其降幅增大,如番茄(Biswojit et al.,2018)、向日葵(Noreen et al.,2017)等。本研究发现,在相同酸度的酸雨处理下生菜的叶绿素质量分数低于上海青。不同酸雨处理下的上海青叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素变化规律为:pH 5.0>CK, pH 3.5 >pH 2.5。低酸度酸雨处理有利于上海青的叶绿素的维持和合成,可能是由于低酸度酸雨未造成作物叶片明显损伤,且酸雨中含有的N、S 养分对上海青叶片起到一定的“施肥”作用(即“施肥效应”大于“损伤效应”),而高酸度酸雨(pH 2.5-3.5)首先使得叶片受到直接损伤,导致叶片中的Mg2+流失,进而对叶绿素的合成产生负面影响,同时还会加速叶片的叶绿素和类胡萝卜素分解,从而降低叶绿素含量(水德聚等,2016)。与上海青不同,生菜的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的变化规律为:CK>pH 5.0>pH 3.5>pH 2.5,这种差异可能与作物种类有关。
酸雨对叶片的光合作用特性也会造成一定影响。叶绿素荧光是一种快速、非破坏性的检测方法(Hu et al.,2021),叶绿素荧光参数的测定可以反映光系统对光能的吸收、传递和耗散的能力,作为研究叶片光合能力的探针,也用于检测植物光合机构对环境胁迫的响应(方怡然等,2019)。相关研究表明,几乎所有的光合作用过程的变化都会通过叶绿素荧光反映出来(Ni et al.,2019)。前人对木荷(殷秀敏等,2010)、大麦(Hu et al.,2021)等研究发现,弱酸性环境可以增加叶绿素荧光参数指标,强酸性环境对其有抑制作用,最明显的表现为对光合作用效率的差异影响。本实验结果表明,生菜的Fv/Fm(最大光合效率)、YII(实际光能转换效率)、qL(光化学淬灭系数)低于上海青,而NPQ(非光化学淬灭系数)高于上海青。随着酸雨酸度的不断提高,生菜和上海青的叶绿素荧光指标呈现先升高后下降的趋势,特别是在作物生长中期强酸雨处理下显著降低,且上海青受到的影响高于生菜,表明弱酸性酸雨环境条件有利于生菜和上海青的生长,强酸性酸雨则抑制叶菜生长。
酸雨对植物的影响最终是反映在植株的生长状况上。产量是反映作物生长状况良好与否的重要指标。本研究发现,pH 5.0 酸雨处理对生菜和上海青的鲜物质质量无显著影响,而pH 3.5 和pH 2.5 酸雨处理导致生菜和上海青的鲜物质质量降低,产量下降,这可能是由于强酸性酸雨处理已对生菜和上海青叶片及其生理机能造成直接伤害,影响光合作用,进而导致产量降低,但弱酸性酸雨对叶片不会造成明显伤害,故对其产量未造成明显影响,这与钟嘉文等(2021)研究结果相似。
可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸、植物原花青素、维生素C 等营养物质是叶菜类作物重要的品质指标,本研究结果发现,酸雨处理对生菜和上海青中这些营养成分产生了影响,表明酸雨可导致蔬菜品质的下降。同时,这些指标质量分数的变化也反映了作物受到酸胁迫的状况。植物体内的可溶性蛋白与可溶性糖是一个重要的生理生化指标,与植物的渗透调节功能密切相关(水德聚等,2016),其合成与调控与多种复杂的生理生化过程及外部环境有关,酸雨胁迫下作物蛋白质和可溶糖质量分数的变化是一个十分复杂的过程(麦博儒等,2010)。游离脯氨酸是植物蛋白质的组成成分之一,在植物面对各种环境压力时会发生积累(Wang et al.,2022),在植物细胞质的渗透调节、降低细胞酸性、调节细胞氧化还原等方面起着重要作用。植物原花青素(陈雪菲等,2020)和维生素C 不仅是植物的营养成分,也都属于植物体中的抗氧化剂。原花青素广泛存在于植物界,具有重要的生物学功能,是植物应对生物和非生物胁迫的一种重要防御手段(苏全胜等,2021),它能与蛋白质结合,帮助清除自由基,参与植物抗氧化等重要的功能过程(Qi et al.,2022),从而防止过氧化(吴金滢等,2022)。维生素C 不仅是植物产品品质的重要指标,而且还可以作为植物抗逆境的重要生理指标,保护机体免于自由基的威胁。本研究结果表明,在低酸度酸雨胁迫下,生菜和上海青的原花青素的质量分数低于对照组,这可能是与酸雨胁迫下可溶性蛋白质量分数先升高后下降有关,原花青素需要和蛋白质结合来应对外界环境变化,且原花青素是一种水溶性色素,酸雨处理会加速其分解。随着酸雨酸度的升高,生菜和上海青的可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸、维生素C 含量呈现“先升高后降低”的趋势,这与油菜(梁骏等,2008)、小白菜(孟赫等,2011)、蕹菜(郑有飞等,2008)等的研究一致,表明生菜和上海青在受到弱酸性酸雨(pH 5.0)胁迫时会激活体内的抗氧化系统(Ren et al.,2018),相关抗性调节物质的含量增加,以提高植物细胞的渗透势以及调节植物体内的氧化还原和新陈代谢过程来适应外界环境的变化,而在强酸性酸雨(pH 2.5-3.5)胁迫下线粒体、叶绿体等细胞器结构受到破坏,自身的调节能力减弱,对应的营养品质指标含量也随之下降。
酸雨对蔬菜的影响不仅与蔬菜种类有关,而且还与酸雨的酸度有关。在不同pH 酸雨影响下,生菜和上海青的叶绿素荧光和可溶性蛋白质、可溶性糖、游离脯氨酸、维生素C 等营养成分的质量分数总体呈现“低促高抑”现象;总体而言,随着酸雨酸度的增强,酸雨会导致两种蔬菜的叶片叶绿素和原花青素质量分数、品质及产量下降。