外源亚精胺对高温运动小鼠机体保护作用及机制研究

李艳红，张姣姣，李 晨，李英英，何恩鹏

（1.新疆师范大学生命科学学院，新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 830017；2.新疆师范大学体育学院，运动人体科学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054）

运动员在运动训练和比赛中均面临高温环境的困扰［1］。机体长时间处于高温环境会出现一系列不良反应，如疲劳、反应迟钝、焦躁不安等，高温环境下运动性疲劳的发生发展加速，影响机体运动能力，严重影响机体健康。如不采取有效预防措施应对高温环境下机体产生的应激反应，将导致机体出现不可逆的损伤，甚至出现高温休克，危及生命［2-3］。研究发现，高温运动时机体活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）会随着环境温度的升高而增加，导致机体处于氧化应激（Oxidative Stress，OS）状态［4-6］，其表现为氧化与抗氧化系统之间失衡。氧化应激导致机体内膜、内皮细胞、平滑肌细胞、纤维组织损伤，加速运动性疲劳的发生。因此，维持细胞稳态的前提是氧化与抗氧化系统之间的平衡［7-8］。

亚精胺（SPD）是一种广泛存在的天然多胺，大量文献报道SPD具有显著的心脏和神经保护作用，其可以逆转衰老引起的动脉硬化，还可以减少老年小鼠内皮细胞的氧化损伤，另有研究表明SPD 减轻了高脂饮食喂养的载脂蛋白E缺陷（ApoE/）小鼠的动脉粥样硬化斑块的形成。补充SPD 还可以改善与衰老相关代谢下降、减少的肿瘤发生等［9］。因此文章通过研究SPD对高温运动小鼠机体的保护作用，以期为研究高温环境下运动健康提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验动物：雄性昆明小鼠32只，三周龄时购自新疆医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK（新）2018-0003；动物房平时温度为23～25℃，实验高温为35～37℃，相对湿度控制在50%～60%，8 只/笼，小鼠自由饮食并定期称重。亚精胺从Sigma 公司购入，分子量为145.25；谷草转氨酶（AST）试剂盒、谷丙转氨酶（ALT）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、6-磷酸-葡萄糖脱氢酶（G6PDH）和乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司；RNA提取、反转录和荧光定量试剂购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 实验动物分组、给药以及训练方法

小鼠四周龄时，将其随机分为四组，即无运动组（CON，Control），常温运动组（RTExe，Room Temperature Exercise group），高温运动组（HTExe，High Temperature Exercise group），高温运动+亚精胺干预组（HTExe+SPD），每组8 只。运动组小鼠进行四天跑台适应运动，分别以速度5m/min 和5min/d 递增，直至20m/min，坡度为7°，训练时间为20mins，训练30d，HTExe+SPD 组在训练前30mins以100mg/kg BW 灌胃SPD，末次运动后立即取血、心、肝、脾、肾、睾丸、腓肠肌和脂肪组织，用0.9%NaCl冲洗组织，-86℃保存至备用。

1.3 实时荧光定量PCR

GAPDH和SPDS引物序列与合成均由上海生工进行，如表1所示。

1.4 统计分析

所有数据以均数±标准差（x±s）表示，统计处理用SPSS23.0 软件进行分析，各组采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，目的基因相对表达量采用△△Ct 法计算，目的基因的相对表达水平用2-△△Ct表示。蛋白表达量分析采用比较灰度值法进行分析。

2 研究结果与分析

2.1 小鼠体重变化

对小鼠体重进行分析，如图1 所示。与HTExe 组小鼠相比，其他三组小鼠体重显著升高（P<0.05），且HTEx+SPD组小鼠体重接近于正常组。结果表明，SPD可以增加高温运动小鼠的体重。

2.2 小鼠血清中AST、ALT含量的分析

试剂盒测定小鼠血清中AST、ALT含量，如图2所示。与HTExe组相比，CON组和HTExe+SPD 组的AST、ALT 水平显著性降低（P＜0.05），但RTExe 组AST、ALT 水平没有显著性差异（（P＞0.05）。结果表明，SPD 可以降低高温运动小鼠的AST、ALT水平。

2.3 小鼠肝脏组织中MDA、SOD含量的分析

试剂盒测定肝脏组织MDA 和SOD 水平，如图3所示。与HTExe组相比，其他三组小鼠的肝脏中MDA 含量显著降低（P＜0.05），而SOD 活力显著升高。结果表明，SPD 可以降低高温小鼠肝脏中的MDA 含量，提高SOD活力减轻高温小鼠肝脏的氧化损伤。

2.4 G6PDH和LDH酶在腓肠肌组织中的活性

试剂盒测定腓肠肌组织G6PDH 和LDH 的酶活性，如图4所示。与HTExe组相比，CON 组的LDH 酶活性显著降低（P＜0.05），RTExe、HTExe+SPD 组没有显著性差异（P＞0.05）。与HTExe 组相比，其他三组的G6PDH酶活力显著升高（P＜0.05）。结果表明，SPD可以提高高温运动诱导的小鼠G6PDH酶活性。

2.5 SPDS基因在腓肠肌的转录水平

荧光定量PCR 检测SPDS 基因的表达量，如图5 所示。与HTExe 组相比，CON、RTExe、HTExe+SPD 组腓肠肌组织中SPDS 基因mRNA 的表达水平显著升高（P＜0.05）。结果表明，SPD 可以提高高温运动诱导的小鼠SPDS基因的表达。

图5 小鼠腓肠肌SPDS基因mRNA表达量（± s，n = 8）

2.6 SPDS蛋白在腓肠肌的表达水平

Western Blot 检测SPDS 蛋白的表达量，如图6 所示。与HTExe 组相比，CON、RTExe、HTExe+SPD 组腓肠肌组织中SPDS蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）。结果表明，SPD 可以提高高温运动诱导的小鼠SPDS蛋白的表达。

图6 小鼠腓肠肌SPDS蛋白表达量（x ± s，n = 8）

3 讨论

3.1 外源性SPD对高温环境运动小鼠力竭游泳时间和体重的影响

研究发现，高温环境下训练、比赛和劳动会加速体液和电解质的丢失，导致机体内环境稳态失衡，出现运动性热应激。当机体处于高温环境时，为保持自身体温的恒定，机体会通过神经（下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴系及交感神经-肾上腺髓质系统的兴奋）、体液进行一系列的反馈调节。这些信息经体温调节中枢整合后引起内分泌腺、皮肤血管等活动的变化，改变机体的散热能力，使体温维持相对稳定状态（科学家通常把32℃以上的训练环境以及35℃以上的生活环境称为高温环境［10］）。

机体长期处于运动性热应激状态，机体耗能会增加，导致体重下降。本研究结果显示，在高温环境下随着运动强度的增加体重减负明显，出现运动性热应激状态。外源性SPD 干预组体重下降则不明显，力竭运动时间显著增加，提示外源性SPD 可以减少机体的运动性热应激伤害，提高机体的调节能力进而提高高温环境下的运动能力。

3.2 外源性SPD对高温环境运动小鼠血清转氨酶的影响

谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）主要分布在肝脏和心肌，其次是骨骼肌和肾脏等组织。正常情况下，血清中的AST和ALT 含量较低，当细胞受损时，细胞膜通透性增加，胞浆内的AST和ALT 释放入血，使血清AST 和ALT 浓度升高，常被作为心肌和肝脏细胞损伤的指标因子。有报道指出，高强度运动和高温环境的双重刺激可以显著提高血清AST 和ALT 含量，提示在高温环境下运动更容易导致心肌、骨骼肌和肝脏损伤，其原因可能与高温环境下高强度运动会使体温升高过度，进而诱发机体ROS 水平和内源性抗氧化能力之间氧化还原失衡，从而导致组织损伤［11-12］。该研究发现HTExe+SPD 组小鼠补充SPD 后，血清AST 和ALT 水平显著降低，且与HTExe 组比差异具有显著性，提示补充SPD 保护高温环境下运动小鼠免受氧化应激的损伤，维持肝脏、心肌和骨骼肌的正常功能。

3.3 外源性SPD对高温环境运动小鼠肝脏MDA、SOD含量的影响

丙二醛（MDA）是细胞膜脂质过氧化最重要的产物之一，它能加剧细胞膜的损伤，脂质过氧化的程度与运动强度、运动环境和机体恢复能力等有关，MDA 作为其最终产物，是组织损伤的重要标志物［13-14］，生理代谢物质含量升高则表明机体自由基生成不能及时清除，增加了自由基对机体的损害。高温环境会造成机体急性缺氧并释放大量的氧自由基，肝脏内MDA 含量上升，引起肝脏内细胞膜受损。该研究结果显示，HTExe组MDA 水平高于其他组，表明高温运动小鼠肝组织活性氧（ROS）增加，肝细胞膜生物大分子受到ROS 攻击引起肝细胞损伤，而补充SPD 可以显著降低HTExe+SPD 组MDA 水平，这证明补充SPD 减少自由基生成，保护肝细胞膜免受氧化应激损害。

超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在于生物体内的抗氧化酶，能够歧化细胞新陈代谢产生的超氧自由基，使之转化成水和氧气，降低自由基对机体的损害，从而保护细胞结构、功能的完整性，能够发挥极其重要的抗氧化作用［15］。研究发现，高温环境会引起机体自由基生成量增加，氧自由基增多使机体内SOD 大量消耗，造成了氧自由基和SOD 水平的不均衡。有报道指出，高温可降低抗氧化酶活性，亦有研究表明，补充SPD可提高SOD的活性［16］。该研究结果表明补充SPD后HTExe+SPD 组SOD水平显著升高，说明SPD可通过增加肝脏SOD活性，保护小鼠肝脏，减少高温应激的损伤。

3.4 外源性SPD对高温环境运动小鼠腓肠肌G6PDH活性及SPDS表达量的影响

6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）作为磷酸戊糖通路上的第一个酶，磷酸戊糖途径除能够为生物体提供能量外，还为脂肪酸、胆固醇的生物合成提供还原型辅酶Ⅱ（NADPH），为核苷酸辅酶、核苷酸的合成提供5-磷酸核糖。磷酸戊糖途径氧化阶段的脱氢反应在生理条件下是不可逆的，因此作为磷酸戊糖途径的第一个脱氢酶，G6PDH 成为葡萄糖氧化分解的重要限速酶。同时，G6PDH 在氧化损伤的防御机制中扮演重要角色，G6PDH活性高低反应机体抗氧化能力［17］。

该实验表明HTExe+SPD 组G6PDH 酶活性较HTExe 组升高，一方面，说明SPD 可以通过增加G6PDH 酶活性提高葡萄糖氧化分解的速度，为机体提供更多能量，从而抑制高温应激损伤，对机体起到保护作用；另一方面，说明SPD 亦可以通过增加G6PDH 酶活性提高磷酸戊糖途径代谢，为脂肪酸的合成提供更多NADPH，提高细胞膜的氧化损伤修复能力，维持细胞的正常生理功能。

SPD 是多胺的一种，大量研究显示外源性SPD 的补充有抗衰老、抗癌、保护心血管、增强免疫、神经调节和神经保护及阻止老年痴呆和改善代谢性疾病的作用。机体SPD 含量主要由细胞合成速度和细胞外摄入量决定，其中外源性补充可以通过肠道吸收且不被降解，并迅速进入全身器官组织。SPD的细胞合成速度随年龄而变化，有研究者分别对3、10 和26 周龄小鼠组织器官的SPD 浓度进行测量，结果显示胰、脑和子宫中SPD 含量基本保持恒定，在小肠中年龄越大SPD 含量越低，而在胸腺、脾脏、卵巢、肝脏、胃、肺、肾脏、心脏和肌肉中SPD含量显著降低［18］。

通过上述分析发现，外源性SPD 可以显著提高高温运动小鼠的运动能力，减少高温运动引起的氧化应激损害。为了验证细胞内源性SPD 合成在抵抗高温引起的氧化应激中的作用，测定了各组腓肠肌亚精胺合成酶（SPDS）基因mRNA 的转录水平以及SPDS 蛋白表达量。结果表明运动可以促进亚精胺合成酶的表达，当运动环境温度过高时机体氧化应激加剧，细胞生理功能受损，内源性SPD 合成减少，而补充外源性SPD 的高温运动组亚精胺合成酶含量增加，提示外源性SPD 可以通过上调SPDS 基因mRNA 的表达增加亚精胺合成酶含量来实现内源性SPD 合成，保护机体免受氧化应激的损害，这可能与SPD 可以促进蛋白质的合成或阻止它们的降解有关。

4 结论

外源性SPD 可显著提高高温环境运动小鼠运动能力，保护高温运动小鼠免受氧化应激的损伤，保持细胞膜系统稳定，维持细胞正常生理状态，其作用机理可能与外源性SPD 促进亚精胺合成酶的表达，进而促进内源性SPD高效合成状态，维持细胞内源性SPD平衡有关。