基于四苯乙烯-罗丹明B的新型比色Fe3+荧光探针的合成及其性能研究

李佳佳，陈佳敏，田勇琪，曾 竟

（新疆师范大学化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830054）

铁元素在生命活动中发挥着重要作用［1-3］，它广泛分布于人体组织中，该元素过量或不足对人体均有害处［4-6］，因此，实现Fe3+的检测显得至关重要。在众多的检测方法中，比色（荧光）检测法由于其操作简便、检测效果好及灵敏度高等优点而受到了广泛关注，人们通过改变比色（荧光）信号基团或识别位点等方法设计了大量的比色（荧光）Fe3+荧光探针。

基于波长范围广和选择性高等优势［7-10］，当Fe3+诱导罗丹明B内酰胺环开环后，探针发射出强荧光信号，罗丹明B信号基团设计的“off-on”型比色荧光探针具有独特的优势［11-13］。该类探针光稳定性好，并伴随着明显颜色变化。四苯基乙烯是聚集诱导发光分子的典型代表，具有合成原料来源方便、结构易修饰、发光性能好等优点，还能有效避免传统有机荧光探针的聚集猝灭（ACQ）现象［14-16］。

鉴于四苯基乙烯及罗丹明B两大荧光母体的各自优势，开发四苯基乙烯-罗丹明B为信号基团的新型荧光探针，以期同时实现四苯基乙烯的聚集诱导荧光特性并发挥罗丹明B的特殊比色荧光识别能力，从而提高Fe3+检测的准确性和灵敏度。到目前为止，本课题组已报道了三个四苯基乙烯官能团化的罗丹明B 衍生物［17-19］，该类物质均具有典型的聚集诱导发光特性，并实现了对Fe3+的比色荧光识别。为获得灵敏度更高、选择性更强的Fe3+比色荧光探针，文章通过2，6-吡啶二甲酰氯连接两大荧光母体，合成得到具有更多含氮配位点的双酰胺化合物L，并表征了该类化合物结构，研究了此化合物的光学性质。相较于之前的工作，该探针对Fe3+表现出更高选择性和灵敏度，同时还能可视化识别Cu2+.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

X-4 显微熔点仪；U-3310 紫外可见分光光度计；Varian 400-MR 核磁共振波谱仪（TMS 内标，CDCl3作溶剂）；Bruker TENSOR27红外光谱仪（KBr压片）；TRACE MS质谱仪。

无水乙醇经金属钠干燥后重蒸得到，实验中使用到的水均来自Milli-Q 超纯水（18.2ΩM，Millipore），2，6-吡啶二甲酰氯（分析纯，阿拉丁试剂公司），其他所用试剂均为市售分析纯或化学纯。

1.2 探针L的合成

RhB-NH2［20］和TPE-NH2［21］参照文献合成且表征数据与文献一致。参照图1 合成探针L：首先将2，6-吡啶二甲酰氯（0.306 g，1.5 mmol）和二氯甲烷（15.0 mL）加入100 mL干燥圆底烧瓶中，混合均匀，冰水浴冷却至0℃.搅拌作用下，缓慢滴入0.375 g（1 mmol）1，1-二（4-甲基苯基）-2-（4-氨基苯基）-2-苯基乙烯（TPE-NH2）的二氯甲烷溶液。TLC跟踪反应至TPE-NH2基本消耗后，滴入0.91 g（2 mmol）罗丹明B酰肼（RhB-NH2）的二氯甲烷溶液，滴加完毕后，冷却至室温，TLC 监测反应。加入20 mL 蒸馏水猝灭反应，水层用二氯甲烷萃取3次（每次30 mL），合并有机相并用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏除去溶剂得粗品，粗品用柱层析分离（石油醚/乙酸乙酯，v/v=3：1），得白色粉末状固体L 0.5 g.

表1 探针L的结构表征

图1 L的合成路线

1.3 性能测试

使用LiCl·H2O，KNO3，NaNO3，AgNO3，FeCl2·4H2O，Mg（NO3）2·6H2O，MnCl2·4H2O，Co（NO3）2·6H2O，Zn（NO3）2·4H2O，Ni（NO3）2·6H2O，Ca（NO3）2·6H2O，HgCl2，BaCl2·2H2O，Cd（NO3）2·4H2O，Cu（NO3）2·3H2O，Pb（NO3）2，A（lNO3）3·9H2O，Cr（NO3）3·9H2O 和FeCl3·6H2O分别配制1×10-2mol/L金属离子储备液。精确称量L，并溶解于重蒸无水乙醇中配置成5.0×10-4mol/L储备液。所有的光谱研究均在EtOH/H2O（50μmol/L，v/v，11/9，Tris-HClpH7.0）体系进行，配制方法：分别移取0.5 mL5.0×10-4mol/L探针L储备液，2.25 mL乙醇，30 μL pH 7.2 的1 mol/L Tris-HCl 的缓冲溶液储备液和2.22 mL 超纯水混合获得50 μmol/L 的探针L 的EtOH/H2O（11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）溶液。激发和发射狭缝宽度均为5 nm.

2 结果与讨论

2.1 探针L的聚集诱导荧光性质

取体积为5mL的小瓶，依次加入0.5 mL探针L储备液、4.5 mL乙醇溶液和0 mL水（不良溶剂），获得水的体积分数为0%待测液。按照此法，分别配制水体积分数10%～90%的待测液。通过荧光光谱法测试了探针L 的聚集诱导荧光性质，结果如图2所示。化合物L 在水体积分数小于30%时，490 nm 处的荧光发射峰强度较弱；当水体积分数为40%时，荧光发射强度显著增强；当水体积分数为80%时，荧光发射强度达到最大值757，比单一乙醇溶液时增强37倍。结果表明化合物L具有典型的AIE特征。

图2 不同比例乙醇/水混合溶液中L荧光光谱图（50 μmol/L，Ex=364 nm，Em=490 nm）

2.2 探针L对pH的响应性

为了进一步考察探针L 在EtOH/H2O（11/9，v/v）的实用性，文章研究L 对pH 的响应性，结果如图3 所示，探针L在pH 4.0～11.0范围内，荧光强度比较平稳，由于大多数情况环境呈中性，因此，随后的实验在pH 值为7.0条件下进行。

图3 L对pH值响应荧光光谱图（50μmol/L，Ex=364 nm，Em=490 nm；Ex=530 nm，Em=582 nm）

2.3 探针L对时间的响应性

为考察探针L的灵敏度，在探针溶液中加入8 equiv.的Fe3+储备液，分别测试了不同时间点的荧光发射峰强度，结果如图4 所示。482 nm 处的荧光发射峰强度随时间的延长而降低，而582 nm 处的荧光强度随时间的延长而增大，但3 分钟后荧光强度变化均趋于稳定状态，说明探针L 是一个响应时间短的探针。因此，随后的实验均采用3分钟后进行测试的方式。

图4 响应时间对L荧光强度的影响（50 μmol/L，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0；a：Ex=364 nm，Em=490 nm；b：Ex=530 nm，Em=582 nm）

2.4 探针L的选择性实验

为了研究L 的选择性，分别将8.0 equiv.Li+、Ag+、K+、Na+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Ni2+、Hg2+、Cu2+、Ba2+、Pb2+、Cd2+、Al3+、Fe3+、Cr3+等金属离子加入到探针L 的EtOH/H2O（11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）体系中，并通过可视化识别、紫外-可见吸收光谱、荧光光谱研究L对金属阳离子的识别能力。

2.4.1 可视化识别

实验结果表明，在可见光下，随着Fe3+的加入，探针溶液由无色变成橘红色；随着Cu2+的加入探针溶液略微变绿；加入其他金属离子时均无明显颜色变化。在365 nm紫外灯照射下，分别加入Fe3+和Cu2+，探针溶液荧光猝灭；分别加入其他金属离子，探针溶液荧光无明显变化。这表明L对Fe3+和Cu2+表现出可视化识别（图5）。

图5 加入不同阳离子（8 equiv.）后，L（50 μmol/L，EtOH/H2O，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）在日光（a）和紫外灯（365 nm）（b）照射下溶液颜色变化图

2.4.2 紫外-可见吸收光谱

紫外-可见吸收光谱如图6所示，随着金属离子的加入，315 nm 处均有吸收峰出现。当加入Fe3+后，吸收峰明显增强，且在562 nm 处出现一个新吸收峰。因此，通过紫外-可见吸收光谱可认定L 对Fe3+可以实现专一性识别。

图6 加入不同金属离子（8 equiv.）后，L（50 μmol/L，EtOH/H2O，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）的紫外-可见吸收光谱图

2.4.3 荧光光谱

荧光光谱实验结果如图7 所示，在不添加金属离子的情况下，490 nm 处荧光发射峰强度为428，582 nm处荧光发射峰强度为6；添加Fe3+后，490 nm处荧光发射强度骤降，呈现荧光猝灭，猝灭率高达97.4%，在490 nm处实现了对Fe3+的turn-off识别。然而，伴随490 nm处的荧光猝灭，582 nm处荧光发射强度表现出突然增强，荧光强度是空白溶液的83倍，在582 nm处对Fe3+实现了turn-on识别。在相同条件下，除Al3+和Cr3+在582 nm处荧光发射峰强度略微增强外，其他金属离子几乎未引起荧光强度改变。因此，荧光光谱图中可看出L 对Fe3+实现了高选择性识别。

图7 加入不同金属离子（8 equiv.）后，L（50 μmol/L，EtOH/H2O，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）的荧光光谱图（a：Ex=364 nm，Em=490 nm；b：Ex=530 nm，Em=582 nm）

以上实验结果表明，L实现了对Cu2+和Fe3+的可视化识别，紫外可见光谱和荧光光谱研究表明L还对Fe3+表现出特有的选择性和专一性。

2.5 探针L的抗干扰性实验

为进一步研究该探针的实用价值，进行了8 equiv.Fe3+与等量其他金属离子共存时的抗干扰实验，实验结果如图8 所示。与空白相比，在不同金属离子存在时，L 的荧光发射强度变化不大，表明该探针具有很强的抗干扰能力。

图8 竞争金属离子（400 μmol/L）和Fe3+（400 μmol/L）共存时，L的（50 μmol/L，EtOH/H2O，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）荧光强度对比图（a：Ex=364 nm，Em=490 nm；b：Ex=530 nm，Em=582 nm）

2.6 荧光滴定实验

利用荧光滴定实验进一步评价探针L对Fe3+的选择性，结果如图9所示。

如图9a 所示，在0～2000 μmol/L 范围内，随Fe3+浓度的增大，在490 nm 处的荧光强度逐渐减小，最终趋于稳定。当Fe3+浓度在30～200 μmol/L 范围内时，与荧光强度有较好线性关系，经拟合得到线性回归方程：y=-1.46×106x+417.37，R2=0.9978.根据检测限公式DL＝3Sd/ρ（其中ρ 是荧光强度与Fe3+浓度的斜率，Sd 是空白标准偏差），得出检测限DL=2.41×10-5mol/L.

如图9c 所示，在0～2000 μmol/L 范围内，随Fe3+浓度的增大，在582 nm 处的荧光强度逐渐增大，最终趋于稳定。当Fe3+浓度在30～200 μmol/L 范围内时，与荧光强度有较好线性关系，经拟合得到线性回归方程：y=1.71×106x-26.01，R2=0.9978.探针L对Fe3+的最低检测限可达5.03×10-6mol/L.

实验结果显示：随着Fe3+浓度的增大L 的荧光发射强度发生相应变化，当Fe3+浓度达到350 μmol/L 后荧光发射强度趋于平稳。结果表明，L对Fe3+响应灵敏，且二者之间有很好的络合作用，探针L可用于线性范围内Fe3+的定量分析。

2.7 探针L的可逆性实验

用EDTA 滴定法检测了L 与Fe3+的可逆结合模式。当向Fe3+与L 溶液（50 μmol/L，EtOH/H2O，11/9，v/v，Tris-HCl pH 7.0）中加入400 μmol/L EDTA 后，490 nm 处荧光恢复，而582 nm 处的荧光发射峰消失。这是由于EDTA 和Fe3+配位能力强于L 与Fe3+的络合作用，致使L 在溶液中游离出来，且螺内酰胺重新处于闭环结构，继而引起荧光强度改变；但是，继续向上述体系中加入400 μmol/L 的Fe3+后，过量的Fe3+与L再次络合，导致490 nm处荧光急剧减弱，而582 nm处的荧光发射强度增强（图10）。上述结果表明探针L具有较强的可逆性。

2.8 L和Fe3+络合机理

为进一步了解L 和Fe3+之间的结合计量比，对L-Fe3+配合物进行了ESI-MS 分析，结果如图11 所示。在m/z=1090.7处出现［L+Fe3++2Cl--1］的碎片离子峰，表明探针L与Fe3+以1：1结合。

图11 L-Fe3+配合物的ESI-MS图

为进一步研究探针L 和Fe3+的作用机理，采用累积滴加法对L 的CD3OD/D2O（9：11，v/v）进行了1H NMR滴定实验。如图12 所示，L 在6.2～6.6 ppm 范围内出现两组峰（6.2，4H，6.6，2H）分别对应于罗丹明B 结构中与氧环相连的芳香质子。

图12 a：在CD3OD/D2O（9：11，v/v）中L的1H NMR谱；b：在CD3OD/D2O（9：11，v/v）加入1.0 equiv Fe3+后L的1H NMR谱

当向L 的CD3OD/D2O（9：11，v/v）中加入1 equiv Fe3+后，上述两组峰消失，这是由于罗丹明B 螺内酰胺结构的开环和Fe3+的加入所引起的芳香环结构的变化所致。基于上述结果，对探针L和Fe3+结合机理进行了初步推测，如图13 所示。L 和Fe3+之间强烈的结合作用导致罗丹明B 螺内酰胺诱导开环，引起变色，聚集状态减弱，故而490 nm处荧光减弱，582 nm波长下荧光增强。

图13 探针L和Fe3+的可能络合机理

3 结论

文章合成了一种基于四苯基乙烯-罗丹明B的新型比色荧光探针L，并对其光学特性进行了研究。实验结果表明，该探针响应时间短，抗干扰能力强，对Fe3+表现出高选择性和高灵敏度，同时还能实现可视化识别Cu2+，整个识别过程在中性环境下进行，具有潜在的应用价值。