弓形虫TgERP 基因的原核表达及间接ELISA 方法的建立

苗书魁，王陆宝，陆桂丽，汪 萍，魏玉荣，夏 俊，魏 婕，米晓云

（1.新疆动物疫病研究重点实验室，新疆乌鲁木齐 830013；2.乌鲁木齐海关，新疆乌鲁木齐 830011）

弓形虫病（toxoplasmosis） 是由弓形虫（Toxoplasmagondii）引起的一种全球性流行的人兽共患寄生虫病[1]。据报道[2-3]，我国普通人群的弓形虫抗体阳性率为8.2%，其中孕妇为8.6%。人类弓形虫感染主要通过摄入未煮熟或含有活组织囊肿的生肉，或通过摄入被弓形虫卵囊污染的食物或水[4-5]。在健康人群和其他大多数动物宿主中，弓形虫很少引起严重症状，但对某些患者可引起淋巴结病或眼弓形虫病[6]，感染孕妇后，可对胎儿造成严重损害，导致出现死胎，胎儿畸形、脑积水、脑钙化，以及弱智儿等[7]。

猫及猫科动物是弓形虫的唯一终末宿主，弓形虫在其体内可进行有性繁殖，形成卵囊[8]。弓形虫胚层发育相关蛋白（Toxoplasmagondiiembryogenesis-related protein，TgERP）是弓形虫卵囊发育阶段的特有蛋白，是子孢子特有抗原，定位于卵囊上，在卵囊上含量丰富。目前对TgERP蛋白的研究较少，该蛋白在弓形虫中的功能尚不清楚，但在植物、无脊椎动物和微生物中，被认为其在抵御各种恶劣外界环境方面有着至关重要的作用[9-10]。近年来随着人们生活水平的提高，家庭饲养的宠物猫数量越来越多。1 只感染弓形虫的猫，每天可排出数百万个弓形虫卵囊，最高可达1 000万个[11]。更重要的是，流浪猫四处走动，对动物和人类健康造成了严重威胁[12]。据弓形虫病流行病学调查[13]，弓形虫感染率与接触传染源概率成正比。本试验将分离的一株猫源弓形虫的TgERP基因插入到原核表达载体pET-28a 中，以上清形式表达TgERP 蛋白；将纯化的重组蛋白pET-28-TgERP 作为诊断抗原，初步建立了间接ELISA 方法。该方法能区分动物感染弓形虫是通过食入猫粪便中的卵囊感染的，还是通过摄入未煮熟或含有活组织囊肿的生肉感染的，为弓形虫病快速诊断与防控提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 虫株和血清

弓形虫TC 株，2012 年4 月从一只2 岁雌性宠物狸猫中分离出。472 份血清样品，由本实验室-70 ℃保存备用，包括采自新疆阿勒泰地区的绵羊血清样品150 份，采自昌吉地区的绵羊血清样品203 份，采自乌鲁木齐市的宠物犬血清样品84 份、宠物猫血清样品35 份。

1.2 主要试剂

弓形虫改良凝集试验（MAT）诊断抗原和间接血凝试验（IHA）试剂盒，由兰州兽医研究所提供；无水乙醇、Tris、Gly、SDS、脱脂奶粉、20×PBS solution、丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺（质量比37.5:1）溶液、APS、TEMED 、T-20、终止液和PBS缓冲液等，均购自上海生物工程技术有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和Anti-Mouse IgG（whole molecule）-Peroxidase antibody produced in rabbit，购自Sigma 公司；蛋白纯化试剂盒His Gravitrap 和His 缓冲液试剂盒，购自GE 公司；TaqDNA 聚合酶，各种限制性内切酶，T4 DNA 连接酶，IPTG 和PCR 试剂盒，均购自TaKaRa 公司；Prestained Protein Ladder，购自Thermo 公司；大肠杆菌感受态细胞DH5α 和BL21（DE3），购自Promega 公司；原核表达载体pET-28a，购自大连宝生物工程有限公司；ELISA 96 孔检测板，购自COSTAR 公司；TMB 单组份显色液，购自索莱宝生物科技有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据NCBI 序列号码LN714502，下载弓形虫TgERP基因序列（315 bp）；采用DNAstar 软件设计TgERP基因上游和下游引物的酶切位点，分别为EcoRI 和XhoI；采用Oligo 7.0 软件设计TgERP基因引物（F：5'-CGGAATTCATGGCGACCGAGCACTCACAC-3'；R：5'-CCGCTCGAGCTAGCCAAGCTTTTCTTGAACCTT-3'）。引物由上海生物工程技术有限公司合成。

1.4 DNA 基因组提取

弓形虫TC 株腹水离心后用生理盐水清洗2次，用500 µL 生理盐水溶解弓形虫，将蛋白酶K按照100 µg/mL 加入到TC 虫株缓冲液中，60 ℃消化30 min，95 ℃加热10 min，使蛋白酶K 完全失活；将此溶液作为TC 虫株DNA 基因组样本，置-20 ℃保存备用。

1.5 TgERP 基因克隆

以TC 虫株基因组为模板，用PCR 扩增TgERP基因。PCR 反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。对PCR 产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.6 阳性重组质粒构建

双酶切TgERP基因和pET-28a 载体，并进行胶回收和纯化；将纯化的TgERP基因和pET-28a载体16 ℃连接过夜，将连接产物转化到DH5α 感受态细胞中；将转化产物涂抹在含有25 μg/mL Kan的LB 固体培养基上，37 ℃倒置培养过夜；挑琼脂板上的单个菌落接种到含有Kan 的LB 液体培养基里，37 ℃、250 r/min 摇菌过夜，第2 天提取质粒；用PCR 和双酶切鉴定重组质粒，然后将鉴定的阳性重组质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中，送往上海生物工程技术有限公司进行菌种测序，将其命名为pET-28-TgERP。

1.7 重组蛋白SDS-PAGE 分析

将阳性重组菌pET-28-TgERP 37 ℃、250 r/min振荡培养至A= 0.6～0.8 时，加入1 mmol/mL 的IPTG，37 ℃诱导表达4 h，同时用诱导表达的载体pET-28a 做阴性对照；收集菌体用PBS 溶解，超声破碎，12 000 r/min 离心10 min；分装上清，将沉淀用PBS 溶解；取表达的蛋白上清和沉淀溶解液各90 μL，加入30 μL 4×SDS 上样缓冲液，煮沸10 min，取15 μL 样品进行SDS-PAGE 分析。

1.8 重组蛋白纯化

按照1.7 的方法扩大培养和诱导阳性菌液pET-28-TgERP 300 mL，对超声破碎的上清应用GE 公司的His 重力柱和His 缓冲液试剂盒，按照说明书步骤进行蛋白纯化。将蛋白通过与Ni-NTA柱特异性吸附及咪唑（20、60、100、5 000 mmol/L）梯度纯化，收集各梯度浓度的咪唑液体1 mL/管，通过SDS-PAGE 进行分析。

1.9 重组蛋白浓度测定

应用BCA 法测定纯化的蛋白浓度，根据样品测定的A562nm平均值，应用标准曲线计算样品浓度。

1.10 制备抗重组蛋白阳性血清

将纯化的蛋白用PBS 稀释后，与弗氏完全佐剂等体积混匀，免疫3 只8 周龄雌性BALB/c 小鼠，100 μg/只腹腔注射0.2 mL。在一免14 和28 d 后，用弗氏不完全佐剂等体积乳化抗原加强免疫。免疫42 d 后断尾采血，分离血清，用间接ELISA 方法检测抗体水平，对抗体效价高的老鼠眼球采血分离血清。

1.11 重组蛋白Western blotting 分析

将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE 后，电转至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉封闭，加入1:500的一抗震荡孵育2 h，PBS 液洗涤3 次，加入1:2 500 的二抗孵育2 h，洗涤3 次，用DAB 显色液显色。

1.12 间接ELISA 检测方法建立

将纯化的重组TgERP 蛋白作为诊断抗原，包被ELISA 板，采用棋盘滴定法确定抗原和血清的最佳稀释度。将抗原使用包被液从200 ng 稀释到25 ng，然后包被到96 孔的ELISA 板中。重组蛋白pET-28-TgERP 免疫老鼠的阳性血清和阴性血清从1:100 稀释到1:3 200，根据阳性和阴性的A450nm比值进行判断，比值≥2.1 判为阳性，反之为阴性。对兔抗鼠的HRP-IgG 稀释度、反应时间和其他条件进行优化。具体步骤：将包被好的酶标板100 μL/孔盖好，37 ℃孵育2 h；弃去包被液，PBST 洗涤3次，按250 μL/孔加入5%的封闭液，37 ℃孵育1 h；弃掉封闭液，用PBST 洗涤3 次，按100 μL/孔加入不同倍比稀释的阳性和阴性血清，并加入对照样品，37 ℃孵育45 min；弃去血清，用PBST 洗涤3次，按100 μL/孔加入稀释的兔抗鼠HRP-IgG 二抗，37 ℃孵育45 min；弃去二抗，用PBST 洗涤3 次，TMB 显色3～5 min；按100 μL/孔加终止液，在酶标仪上读取吸光值A450nm。

1.13 间接ELISA、MAT 和IHA 方法检测血清样品

根据文献[14]采用MAT 方法，按照试剂盒说明书应用IHA 方法和1.12 建立的间接ELISA 方法，分别检测472 份羊、猫和犬血清样品。

2 结果

2.1 PCR 扩增TgERP 基因

以提取的弓形虫基因组为模版，成功通过PCR扩增出TgERP基因，目的片段大小为315 bp（图1）。

图1 TgERP 基因PCR 扩增结果

2.2 重组质粒鉴定

以重组表达质粒pET-28a-TgERP 为模板进行PCR 扩增，得到与预期大小相符的315 bp 目的片段；重组表达质粒经XhoI 和EcoRI 双酶切后，得到与预期大小相符的315 bp 的TgERP基因和约5 400 bp 的空载体pET-28a（图2），表明TgERP基因被成功插入到表达载体中。经测序结果比对，阳性重组表达质粒pET-28a-TgERP 与GTl株TgERP基因序列完全一致。

图2 重组质粒pET-28-TgERP 的鉴定结果

图3 重组蛋白pET-28-TgERP 的纯化结果

2.3 重组蛋白诱导表达和纯化

重组蛋白pET-28-TgERP 经IPTG 诱导后进行SDS-PAGE 分析，发现表达产物为上清表达，大小约16 ku，与预期大小一致，阴性对照没有出现该条带。应用咪唑梯度浓度纯化蛋白，结果发现表达产物在60 和500 mmol/L 咪唑浓度中被洗脱。

2.4 重组蛋白的浓度测定

根据样品测定的A562nm平均值，应用标准曲线计算出检测样品的蛋白质质量浓度，发现重组蛋白pET-28-TgERP 质量浓度最高达到1.6 mg/mL。

2.5 间接ELISA 检测方法建立

筛选的重组蛋白TgERP 抗原包被浓度最终为50 ng/孔，阳性血清最佳稀释度为1:200，抗鼠二抗最佳稀释度为1:15 000，封闭液为5%的脱脂奶粉，阴性血清A450nm均值为0.106。检测样品A450nm＞0.212，判定为弓形虫抗体阳性，反之为阴性。

2.6 3 种方法检测血清样品

应用间接ELISA、MAT 和IHA 方法分别检测了472 份羊、猫和犬的血清样品，发现弓形虫抗体阳性率分别为1.0%、3.8%和3.4%（表1）。

表1 3 种检测方法对比结果

3 讨论

弓形虫的主要感染途径是口腔感染、先天性感染和血液循环系统感染。MAT 和IHA 两种方法可以检测动物通过任何一种途径感染弓形虫情况，包括是通过食用了动物组织包囊还是食用了猫科动物粪便中的卵囊，而以TgERP 蛋白为包被抗原建立的间接ELISA 方法只能检测动物从卵囊途径感染弓形虫情况。TgERP 是弓形虫卵囊发育阶段的特有蛋白，是子孢子特有抗原，定位于卵囊上，为此本研究原核表达了TgERP 蛋白，并以该蛋白建立了间接ELISA 方法。本研究应用建立的间接ELISA 以及MAT 和IHA 方法，分别检测了472 份羊、犬、猫血清样品，其中在353 份羊样品中，间接ELISA 方法检出2 份阳性，MAT 和IHA 分别检出16 份和14 份阳性，进一步验证了羊感染弓形虫的主要途径是通过食用含有弓形虫的组织包囊，而很少通过食用含有卵囊的食物感染。MAT 和IHA检出的弓形虫阳性率（4.5%）比IHA（4.0%）略高，这可能是在人为判定凝集点（抗原抗体结合）上存在误差。3 种方法检测犬和猫血清样品的检测结果一致，证明检出的阳性动物是通过食入猫科动物粪便中的卵囊感染的。

随着人们生活水平的提高，家庭饲养宠物犬猫数量越来越多，流浪犬猫也随之增多。这些流浪宠物每天徘徊在人们生活的地方，对人类健康造成了威胁。新疆是全国畜牧业生产基地，有大量的草原、牧区，羊肉和猪肉是该地区人们生活食用的主要肉类。弓形虫流行病学调查显示[13]，弓形虫感染率与接触传染源概率成正比。人类和动物关系密切而复杂，在食物链中互相竞争又互相依存。本研究建立了间接ELISA 方法，并应用MAT 和IHA方法作对照，目的是建立能区分动物感染弓形虫途径的方法，便于对弓形虫病采取有效的防控措施。

据相关报道[9-14]，TgERP 蛋白序列变异率为0～0.96%。本研究将TgERP 蛋白氨基酸序列在NCBI 数据库中进行比对，显示变异率为0，与田维鹏等[9-10]的比对结果相近，说明该蛋白高度保守，可作为血清学诊断方法的候选抗原，也可作为疫苗研究的候选抗原。本研究为弓形虫病快速诊断方法的建立和疫苗的研发奠定了基础。