不同检测技术在K 亚群禽白血病病毒检测中的应用

赵方钰，崔慧珍，王一新，常 爽，蔡曼珊，赵 鹏

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；2.广东省农业科学院动物科学研究所，广东广州 510000）

禽白血病（avian leukosis，AL）是由禽C型逆转录病毒群的禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）感染引起的一种禽肿瘤性疾病，包括淋巴细胞性白血病、骨髓性白血病及红细胞性白血病等[1-3]。根据宿主范围和不同毒株间的相互干扰作用以及病毒囊膜糖蛋白的抗原构造，可将ALV分为11 种亚群（A—K），其中E 亚群属于内源性ALV，不具有致病性或致病性很低，而K 亚群ALV（ALV-K）是从我国地方品系鸡中首先分离到的新亚群[4-6]，近年来在黄羽肉鸡和地方品系鸡中报道较多。与其他亚群相比，J 亚群具有更强的致病性及传播能力，危害更大[7]。流行病学调查[8-10]显示，A、B、J、K 是我国流行范围最广且危害最严重的4 种主要代表亚群。不同品种鸡感染ALV后表现不同类型的临床症状，如生长迟缓，饲料利用率低，多种脏器肿瘤并且诱导免疫抑制等，给家禽养殖业造成了严重经济损失[11-12]。因此AL 被列为我国种禽场必须要实现净化的主要禽病之一。

在实施AL 净化过程中，尽早检出和淘汰ALV 阳性雏鸡对于最大程度降低病毒垂直传播及其带来的早期水平传播极为重要。目前最简单快速的初筛方法就是采集雏鸡胎粪进行ALV 群特异性衣壳蛋白27（protein 27，p27）抗原检测，以此首先将经垂直传播感染带毒的雏鸡检出淘汰。实验室中常用的ALV 检测方法有病毒分离、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光测定（IFA）等[13-15]。ALV p27 抗原ELISA 是目前实施净化用途最广泛的检测技术，已在AL 净化中被广泛应用多年。目前市场上有多种商品化ALV-p27 抗原ELISA 检测试剂盒，其灵敏度和特异性有所差异[16-17]。磁微粒化学发光技术是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析技术，目前已有企业开发了用于检测p27抗原的磁微粒化学发光检测试剂盒，但其应用效果尚未得到验证。本研究通过对7 日胚龄SPF 鸡胚经卵黄囊接种ALV-K，构建鸡胚垂直感染携带ALV-K模型，分别用3 家公司的ALV-p27 抗原ELISA 检测试剂盒、磁微粒化学发光检测试剂盒以及胶体金检测试纸条进行检测和结果比较，以期为评价不同试剂盒或不同检测方法在净化中的价值提供评估模型。

1 材料与方法

1.1 毒株与细胞

ALV-K 野毒株（ALV-K JS11C1 毒株，Genbank 登录号KF746200.1），由山东农业大学家禽肿瘤病实验室于2012 年从江苏省某地方品系保种鸡群中分离鉴定和保存；用于病毒增殖的DF-1 细胞系，购自美国ATCC 公司，由山东农业大学家禽肿瘤病实验室保存；无特定病原（specific pathogen free，SPF）鸡胚，购自济南斯帕法斯家禽有限公司。ALV-K 在DF-1 细胞上增殖后，按照Reed-Muench 法测定其细胞半数感染量（50%tissue culture infective dose，TCID50），结果为3.5×103TCID50/mL。

1.2 主要仪器及试剂

全自动化学发光免疫分析仪（规格型号Shinei1910），购自深圳迎凯生物科技有限公司；磁微粒化学发光检测试剂盒，购自郑州禾旭生物科技有限公司；Biotek Synergy H1 酶标仪（规格型号H1M），购自广州达瑞生物技术股份有限公司；ALV ELISA 抗原检测试剂盒，为国内3 家试剂盒公司生产，根据企业要求分别编号为A、B、C；胎粪样品稀释液为无菌PBS；抗凝剂为肝素钠。胶体金检测试纸条，购自无锡某诊断试剂生产企业。

1.3 SPF 鸡胚病毒接种与样品采集

将ALV-K 以500 TCID50/枚的剂量接种50 枚7 胚龄SPF 鸡胚卵黄囊，另10 枚鸡胚接种生理盐水作为阴性对照；待雏鸡出壳后进行编号，逐一采集胎粪以及无菌抗凝血；将胎粪与样品稀释液充分混匀置于冰盒，12 000 r/min 离心2 min 后，用规格为0.22 μm 的无菌滤器过滤，取100 μL 滤液接种至已长成单层的DF-1 细胞进行病毒分离，将培养7 d 后的细胞上清冻存于-80 ℃备用，剩余未接种的胎粪样品冻存于-80 ℃备用；将无菌抗凝血以3 000 r/min 离心3 min，取上层血浆接种DF-1 细胞进行病毒分离，同样取培养7 d 后的细胞上清冻存于-80 ℃备用。

1.4 ALV-p27 抗原检测

将3 种类型样品（胎粪以及胎粪、血浆的病毒分离细胞培养上清）反复冻融3 次，恢复至室温后，分别取100 μL 样品进行ALV-p27 抗原检测。以3 家公司ALV-p27 抗原ELISA 检测试剂盒、磁微粒化学发光检测试剂盒以及胶体金检测试纸条对不同样品进行检测，具体操作按各试剂盒使用说明书进行。对于ELISA 检测，使用Biotek Synergy H1 酶标仪读数获得样品吸光度值（OD 值），再按照说明书计算方法得出样品与阳性对照的比值（S/P）；对于磁微粒化学发光检测，通过仪器显示的样品发光值计算S/P；对于胶体金检测，参照说明书以显色度深浅进行眼观判定。

2 结果与分析

2.1 磁微粒化学发光检测试剂盒与ELISA 试剂盒检测结果比较

接种ALV-K 后的SPF 鸡胚共孵出雏鸡22 只，磁微粒化学发光检测试剂盒与3 家公司ELISA 试剂盒检测结果见表1。结果显示：胎粪样品及病毒分离细胞上清经3 家公司ELISA 试剂盒检测皆判定为阳性，但是读值有所差异，大多数样品经A公司ELISA 试剂盒检测OD 值过高，超出仪器范围，为强阳性；同公司不同样品对比，除个别样品外，经病毒分离后的细胞上清中ALV-K 含量更高。经磁微粒化学发光检测试剂盒检测，胎粪及病毒分离细胞上清也均为阳性，与3 家公司ELISA 试剂盒检测结果完全一致，但磁微粒化学发光检测试剂盒检测读数更高，便于直观判定结果。

表1 磁微粒化学发光检测试剂盒与3 家公司ELISA 试剂盒检测结果（S/P）对比

2.2 胶体金检测试纸条与ELISA 试剂盒检测结果比较

鸡胚接种ALV-K 后孵出的22 只雏鸡，其所有胎粪样品、胎粪病毒分离细胞上清和血浆病毒分离细胞上清经胶体金检测试纸条检测均为阳性，与3 家公司ELISA 试剂盒检测结果完全一致（表2）。胶体金检测试纸条仅可根据显色情况做出定性判断，无法显示读数差异。

表2 胶体金检测试纸条与3 家公司ELISA 试剂盒检测结果对比

2.3 阳性胎粪不同稀释度样品检测结果对比

随机抽取两个阳性胎粪样品，分别做5 个稀释梯度（2-5～2-9），再分别用胶体金检测试纸条、磁微粒化学发光检测试剂盒和3 家公司ELISA 试剂盒进行检测，结果见表3。当稀释至2-8梯度时，3 家公司ELISA 试剂盒和磁微粒化学发光检测试剂盒均可检测出阳性，但稀释至2-9梯度时结果出现差异。K1 阳性胎粪稀释到2-9梯度时，磁微粒化学发光检测试剂盒和A 公司ELISA 试剂盒均可检测出阳性，而B 公司和C 公司ELISA 试剂盒检测判定为阴性；K2 阳性胎粪稀释到2-9梯度时，磁微粒化学发光检测试剂盒和A、B 公司ELISA 试剂盒均可检测出阳性，而C 公司ELISA 试剂盒检测判定为阴性。胶体金检测试纸条的灵敏度最低，在K1 和K2 阳性胎粪稀释到2-8和2-9梯度时，均无法检出。

表3 不同方法对胎粪稀释样品检测结果对比

3 讨论

ALV-K 是2012 年王鑫等[6]首次从我国地方品系鸡中鉴定到的ALV 新亚群。经推测，该病毒可能已在我国地方品系鸡中长期定殖。ALV-K 作为最晚发现的新亚群，尽管其致病性弱于其他亚群，但是传播范围和传播能力依然很强，尤其是在黄羽肉鸡和地方品系鸡中流行更为广泛[18]，给养禽业造成了一定经济损失。控制ALV 传播的最有效手段仍然是种源净化，而灵敏特异的检测技术是实现净化的重要技术支撑。ALV 的群特异性抗原p27蛋白是检测的常用抗原靶标[19]，目前可以通过不同方法检测ALV-p27蛋白判定是否感染。长期以来，针对p27 抗原的ELISA 试剂盒一直是批量样品检测的首选，特别是在数量庞大的出壳雏鸡胎粪检测方面发挥了关键作用。

此前，不同p27 抗原ELISA 试剂盒的对比主要是将不同滴度的ALV 接种细胞后取上清进行ELISA 检测[20-21]，其优点是样品阴阳性结果明确，容易判定和比较灵敏度，缺点是样品过于完美化，难以反映出胎粪、血浆等不同性质样品对于检测的实际干扰。本研究通过7 胚龄SPF 鸡胚经卵黄囊接种ALV-K 建立垂直感染模型，以确定的ALV-K感染样品构建了检测样品盘。即待雏鸡出壳后采集1 日龄胎粪、血浆接种DF-1 细胞进行病毒分离（病毒分离一般作为判定金标准），37 ℃温箱培养7 d收取细胞上清，收集胎粪以及胎粪和抗凝血的病毒分离细胞上清形成检测样品盘，能够相对较好地弥补单纯细胞样品评估方式的不足。本研究分别使用磁微粒化学发光检测试剂盒、ELISA 试剂盒、胶体金检测试纸条3 种方法检测ALV-K。结果表明，磁微粒化学发光技术灵敏度更高，特异性更强，且操作简单、耗时短，易于自动化，节省了人工成本。传统ELISA 方法完成检测约需3 h，且对加样速度有要求，而磁微粒化学发光技术仅需0.5 h 即可得出结果。不同病毒载量阳性样品的倍比稀释试验可以发现，磁微粒化学发光技术的灵敏度更高，减少了漏检阳性鸡带来的损失，为AL 净化提供了新的技术支持，有助于加速ALV-K 净化。当然，本研究建立的检测方法评估模型也有不足之处，如建立的阳性和阴性样品盘均为SPF 鸡样品。需要强调的是，我国品质繁多的各种品系鸡中，内源性ALV p27 蛋白表达规律非常复杂，比SPF 鸡p27蛋白复杂得多。如果能够在更多不同品系鸡特别是地方品系鸡中开展类似评估，将更加有助于科学评估不同检测技术的灵敏度和特异性。

综上，磁微粒化学发光检测试剂盒、ELISA检测试剂盒和胶体金检测试纸条检测灵敏度存在一定差异，胶体金检测试纸条灵敏度有限，磁微粒化学发光技术灵敏度优势明显且易于判定，耗时更短，具备灵敏度和耗时短双重优势。