云南省临沧市猪戊型肝炎病毒流行株遗传进化分析

杨国琴，王国君，宋春莲，蔡懿琳，武 鑫，柴 俊，李文贵，朱培英

（1.滇西科技师范学院生物技术与工程学院，云南临沧 677000；2.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201）

戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）为单股正链 RNA 病毒，全长约7.2 kb，一般包括3 个部分重叠的开放阅读框——ORF1（约5 000 nt）、ORF2（约1 920 nt）和ORF3（约340 nt），另外其5'末端含有甲基鸟嘌呤帽子结构，3'末端带有poly A 尾巴。HEV 首次在1982 年被发现，当时被命名为肠道传播的非甲非乙型肝炎病毒。1990 年Reyes 等[1]首次获得HEV 全基因克隆并对其进行了序列分析。1997 年美国学者在本土猪上分离出1株HEV，发现其与人类HEV 有极高的同源性，还可以感染黑猩猩、鹿、兔、骆驼、恒河猴、大鼠等其他动物，首次证实了HEV 有跨物种传播的可能性[2-3]。到目前为止，越来越多的研究发现，HEV在全球多种动物中广泛分布与传播，并且可由动物传播给人类，是一种人兽共患传染病病原。随着HEV 感染率的不断增高，该病越来越受到国内外研究者的重视。因此，本研究从云南省临沧市部分地区采集样品，对HEV 进行分子流行病学调查以及流行株的遗传进化分析，以期为本地区该病的科学防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021 年9 月到2022 年6 月，从临沧市辖区内的云县、凤庆县、双江县多家猪散养户和规模养殖场，采集临床健康猪粪便样品153 份，从位于临沧市中心的两家屠宰场，采集屠宰猪胆汁54 份、肝脏36 份，-50 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

逆转录试剂盒、Marker 等，购自天根生化科技（北京）有限公司；2×TransTagHIFIMix II，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸染料，购自赛百盛生物科技有限公司；RNA 提取试剂TRIZOL、凝胶快速回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、pEASY-T1 载体和感受态细胞等，购自北京全式金生物技术股份有限公司。氯仿、异丙醇和75%乙醇等，为分析纯试剂。

1.3 引物合成

对GenBank 上登录的HEV 基因组全长序列进行序列比对，选取ORF2 基因保守区域，用Primer 6.0 生物软件设计2 套特异性引物（表1），由上海生工科技有限公司昆明分公司合成，其中137 bp引物用来检测阳性率，348 bp 引物用来扩增片段。

表1 HEV 检测引物

1.4 总RNA 提取及目的基因扩增

1.4.1 总RNA 提取 取少量粪便，加入 0.5 mL生理盐水，充分混匀后，4 ℃ 冰箱放置过夜，4 ℃，2 000 r/min 离心10 min；取300 μL 上清，加1 mL Trizol 裂解液，振荡混匀，4 ℃静置5 min；加200 μL氯仿振荡混匀后，静置5 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心15 min；取最上层300 μL 上清，将其加入新离心管中，再加500 μL 异丙醇，颠倒混匀，4 ℃静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min；弃上清，加1 mL 75%的乙醇剧烈旋涡，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min；弃掉液体，用吸水纸吸去管壁内残留液体，在超净工作台内风吹5 min，使剩余酒精挥发；加入40 μL DEPC 水/ddH2O，吹打混匀，-80 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 cDNA 合成以及目的基因扩增 cDNA 合成，使用天根反转录试剂盒。冰上配制以下反应液：5×FASTKing-RT SuperMix 4 μL、模板RNA 8 μL、ddH2O 8 μL，总体积20 μL。反应条件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。目的基因扩增：第一轮 PCR 扩增，总反应体系为 25 μL，其中2×TransTagHIFI Mix II 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，Nuclease-free Water 8.5 μL，cDNA 2.0 μL；反应条件：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，预变性到延伸35 个循环后72 ℃延伸7 min。第二轮扩增，将第一轮PCR产物稀释100 倍后作为模板进行第二轮扩增，反应条件与第一轮相同，循环次数改为25 次。

图1 137 bp RT-nPCR 产物电泳结果

图2 348 bp RT-nPCR 产物电泳结果

1.4.3 目的基因回收、基因克隆及测序 将第二轮PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，对阳性PCR产物用凝胶快速回收试剂盒回收纯化，然后连接到pEASY-T1 载体上转化到感受态细胞，提取质粒后送至昆明擎科生物技术公司测序。

1.4.4 序列分析及遗传进化树构建 从GeneBank中选择37 条HEV I—VIII 型参考序列（表2），与本试验扩增得到的6 份348 bp 片段，用DNAstar等软件分析序列的同源性，利用 MEGA 6.0 等软件构建遗传进化树。

表2 37 条HEV 参考毒株信息

2 结果与分析

2.1 巢式PCR 扩增

巢式PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳100 V 35 min 后，可见约137 bp 特异性条带（图1）和348 bp 特异性条带（图2）。243 份样品的检测结果（表3）显示：从临沧市各地区采集的153 份猪粪便样品中检出HEV 137 bp 阳性38 份，从90份肝脏、胆汁样品中检测出HEV 137 bp 阳性23 份，总阳性率为25.1%（61/243）。结果表明，所有采样地区都存在HEV 流行，提示猪HEV 感染在临沧市可能较为广泛。

2.2 核苷酸同源性分析

对获得的6 份HEV 348 bp 扩增片段，根据阳性样品编号将其依次命名为LcSwine3、LcSwine4、LcSwine8、LcSwine16、LcSwine18 和LcSwine25。用DNAstar、SDT 软件进行同源性分析发现：6 份HEV 348 bp 扩增片段的核苷酸同源性为80.5%～94.1%，与HEV I、II、III、V、VI、VII、VIII 型代表株的同源性分别为75.0%～81.7%、72.7%～77.0%、72.7%～79.3%、75.7%～80.7%、75.0%～81.0%、73.3%～80.3%、71.3%～76.1%，与HEV IV 型代表株的同源性为80.5%～94.1%，与我国人源代表株AJ272108BeijingHuman 的同源性分别是87.7%、86.0%、81.3%、81.3%、85.7%、87.7%（图3）。其中：LcSwine8 和我国人源参考株AB197673ChinaHuman 同源性最高，达到94%；LcSwine4 与人源毒株JQ655733BeijingHuman 同源性最高，达到94.7%。上述结果提示，临沧市HEV流行株可能在人与猪之间循环传播。

应用MEGA、Itol 软件对所得6 份仔猪HEV核苷酸序列进行遗传进化分析。从所构建的系统进化树（图4）分析可知：本研究获得的6 份HEV 序列皆属于基因IV 型，但LcSwine3 和其他分离株不在同一小分支上，属于4b 亚型，其他分离株在同一个小分支上，属于4a 亚型，其中LcSwine4 和人源毒株JQ655733BeijingHuman属于同一分支，说明猪源HEV 与人源HEV 同源性极高。

3 讨论

国际病毒分类委员会（ICTV）已正式将HEV 归属于戊型肝炎病毒科戊型肝炎病毒属[6]。目前，HEV 至少被分为8 种基因型。基因I 型和II 型只感染人类，且基因I 型仅在亚洲和非洲流行[7]，并与这些地区的大规模水源性疫情有关。基因II 型最初是从墨西哥非甲非乙型肝炎暴发期间采集的粪便样本中被分离出来的[8]，但近年来纳米比亚、尼日利亚和埃及也有基因II 型的报道。基因III 型和IV 型属于人兽共感染型，可感染人类以及猪、黑猩猩、恒河猴、鹿和兔子等多种哺乳动物，其中基因III 型最开始在欧洲国家以及日本、美国等发达国家中流行，2008 年于水生[9]在上海市奉贤区某猪场中分离出1 株基因III 型毒株，首次证明我国也存在基因III型。基因V 型和VI 型是从日本的野猪中被分离到的；基因VII 型分离自中东国家的果蝇；基因VIII 型分离自我国新疆的双峰驼。到目前为止，我国流行的HEV 基因型已从最初的基因I型变为以人兽共感染为主的基因IV 型。HEV 可以由动物向人类传播，传播途径多为粪- 口传播，即通过饮用被污染的水或食用被污染的食物而感染[10-11]，但食用未煮熟的感染HEV 的动物组织或内脏也可导致食源性感染[12]。本研究对采自临沧市的6 份阳性样品进行HEV 核酸特异性扩增测序、同源性比较以及系统进化树分析，发现阳性样品均属于基因IV，与以往的调查结果一致[13-14]，表明临沧市猪感染的HEV 基因型主要为人兽共感染的基因IV 型。243 份样品的检测结果显示，目标片段137 bp 阳性共61份，阳性率为25.1%。由于137 bp 片段太短，而且高度保守，所以选择了相对较大的348 bp片段进行分析。研究发现，获得的6 份序列属于基因IV 型下两个不同的亚型，在系统进化分析时集聚形成两个分支。LcSwine4 和人源分离株JQ655733BeijingHuman 同源性最高，属于同一分支。另外也有研究[15]表明，猪HEV 与人HEV的基因同源性高达99.7%～100%，猪HEV 可跨种传播感染人类，且猪HEV 传播到人类后，其毒力会大大增强，这给公共卫生安全带来了极大隐患。

2016 年5 月，世界卫生大会通过了首份《2016—2021 年全球卫生部门病毒性肝炎战略》。该战略强调了全民健康覆盖的重要作用，提出到2030 年消除病毒性肝炎这一公共健康威胁（与2015 年基线数据相比，新发慢性感染减少90%，死亡率降低65%），并包括一份通过实施预防、诊断、治疗和社区干预战略来实现消除的路线图。许多成员在全球卫生部门战略的指导下，制定了全面的国家或地区肝炎规划和消除战略。本研究从临沧市部分地区的猪场、散养户和屠宰场采集样品进行HEV 检测，发现猪群中存在HEV 流行，且流行的毒株都属于人兽共感染的基因IV 型。猪是人兽共感染HEV III、IV 基因型的重要贮存宿主，因此准确有效地诊断出猪戊型肝炎，尽快隔离、清除HEV 感染猪，避免其他健康猪以及饲养员受到HEV 感染，不仅可以保障养殖环境安全，从源头保证猪源性食品安全，也是切断人感染HEV 的关键措施之一，具有重要的公共卫生学意义。