2022 年云南省边境地区牛蓝舌病病毒及阿卡斑病毒抗体检测

谢佳芮，寇美玲，陈文瑾，李桂芬，苗海生

（云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

蓝舌病（bluetongue，BT）是由蓝舌病病毒（bluetongue virus，BTV）引起的一种通过吸血库蠓传播的虫媒病毒病，牛、羊等反刍动物对其易感，致死率为 20%～30%，目前尚无有效的治疗方法[1]。BTV不同血清型间缺乏有效的交叉免疫保护，因而会出现不同血清型毒株在同一区域混合流行的情况，这给 BT 防控带来了极大挑战[2]。阿卡斑病（Akabane disease）是由阿卡斑病病毒（Akabanne disease virus，AKAV）引起牛、绵羊、山羊胎儿的先天性疾病，临床上以妊娠母羊的流行性流产，产死胎、畸形胎，新生胎儿发生关节弯曲为特征。我国部分牛、羊血清中含有AKAV 抗体，揭示我国有该病存在[3]。BTV 和AKAV 主要侵害反刍动物，其中牛、绵羊、山羊对其最易感，其流行具有明显的季节性和地区性，热带、温带湿热的夏秋季以及吸血昆虫活跃季节，池塘、河流较多的地区，多呈地方性流行或散发[4]。

云南省地理位置特殊，气候复杂多变，生态系统多样，自然资源丰富，这为蠓虫提供了孳生栖息的良好环境。同时云南省边境地区与周边国家交往频繁，是主要的陆上通道。与云南省相邻的东南亚国家动物疫情不断发生，动物带毒情况较为普遍，尤其是虫媒病毒病流行严重。近年来，国内牛肉消耗量快速增长，大量牛通过口岸或边境进入我国境内，因此云南省边境地区的虫媒病疫情防控形势严峻[3]。

为掌握云南省边境地区牛群BTV 和AKAV 感染情况，全面了解这2 种病原在云南省边境地区的分布情况和危害程度，本研究应用cELISA 检测试剂盒，对云南省9 个边境县（市）采集牛血清进行BTV、AKAV 抗体检测，评估这2 种病原的感染状况和境外传入风险，以期为边境地区这2 种疫病防控政策研究与制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 病例定义

经cELISA 抗体试剂盒检测为BTV 或AKAV抗体阳性的牛为抗体阳性个体；场内至少有 1 头BTV 或AKAV 抗体阳性个体的牛场为抗体阳性场。

1.2 样本来源及抽样原则

牛血清样品，由当地动物疫病防控机构随机采自云南沧源、勐海、勐腊、芒市、盈江、富宁、景洪、澜沧、施甸9 个边境县（市）的22 个养殖场、88 个散养户；采样地点，选择气温高、降雨量大、日照时间长、相对湿度大，适于媒介昆虫库蠓生长和繁殖的地区。每个县（市）按所属地理位置划定采样区域，随机抽取养殖场1～9 个、散养户1～19个；场户内，根据存栏量按比例通过颈静脉随机采集牛血清样品。各地区具体采样信息见表 1。

1.3 主要仪器和材料

BTV、AKAV cELISA 检测试剂盒、PBST（磷酸盐缓冲液 + Tween 20），为云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室制备；PBS 干粉、Tween 20，购自云南丰科生物科技有限公司；Multiskan FC 酶标仪，购自Thermo 公司。

1.4 抗体检测

1.4.1 BTV、AKAV血清抗体 在96孔ELISA板，每孔加12 μL 待检血清和阴、阳性对照样品；按1:100 稀释豚鼠竞争抗体，每孔加入50 µL 稀释好的竞争抗体，震荡混匀，37 ℃温育1 h；用 PBST洗液洗板3 次，拍干；按1:1 000 稀释兔抗豚鼠酶标二抗，每孔50 μL，37 ℃温育30 min；用 PBST洗液洗板5 次，拍干；每孔加50 μL 底物反应液，37 ℃避光温育10～15 min，加50 μL 终止液终止反应，用酶标仪在450 nm 波长下读取结果。质控标准：两个阳性对照孔A450≤0.2，两孔A450差距＜0.05，两个阴性对照孔1.0 ≤A450＜1.6，两孔A450差距＜0.2。判定标准：抑制率（PI）=（阴性对照A450平均值-样品血清A450）/阴性对照A450平均值×100%计算，抑制率≥50%时判为抗体阳性，否则为阴性[5]。AKAV 血清抗体检测方法与BTV一致。质控标准：两个阳性对照孔A450≤0.2，两个阴性对照孔A450＞0.8。判定标准：按照公式抑制率（PI）=（1- 样品血清 / 阴性对照A450平均值）×100%计算；抑制率≥40% 时判为阳性，否则为阴性[6]。

表1 云南省边境地区样品采集信息

1.4.2 检测结果分析 利用IBM SPSS Statistics 22 软件对检测结果进行统计分析，用卡方检验进行数据间显著性分析，用 Excel 2007 软件统计数据。根据样品采样记录，按采样地区、牛品种、牛来源、采样时间和采样场点进行分类统计。

2 结果与分析

2.1 总体情况

在1 820 份血清样品中检出1 207 份BTV 抗体阳性，样品阳性率为66.32%（1 207/1 820），场户阳性率为96.36%；在1 088 份血清样品中，检出350 份AKAV 抗体阳性，样品阳性率为32.17%（350/1 088），场户阳性率为84.38%。因采样牛群均未免疫过BTV、AKAV 疫苗，以上样品阳性率可视为各病原的自然感染率。上述结果表明，云南省边境地区这2 种病原流行较普遍，感染较严重。

2.2 地域分布

不同地区统计结果（表2）显示：各县（市）牛BTV 样品阳性率为43.50%～93.00%，AKAV 样品阳性率为12.90%～50.00%，不同地区间的差异有统计学意义（P＜0.01）。结果表明，这2 种病原在云南省边境地区存在一定的区域流行差异。

表2 2022 年不同地区牛BTV、AKAV 抗体检测结果统计

2.3 群间分布

2.3.1 牛来源 不同来源牛统计结果（表3）显示：境内本地牛BTV 样品阳性率为67.41%（658/976），入境牛为100%（44/44），两组数据差异有统计学意义（P＜0.01）；境内本地牛AKAV 样品阳性率为36.29%（192/529），入境牛为18.18%（6/33），两组数据差异有统计学意义（P＜0.01）。结果表明，不同来源牛2 种病原的感染状况不一，其中入境牛BTV 感染严重，而境内本地牛AKAV 感染较重。

表3 不同来源牛BTV 和AKAV 抗体检测结果统计

2.3.2 牛品种 不同品种牛统计结果（表4）显示：黄牛BTV 样品阳性率为73.22%（577/788），西门塔尔牛为72.00%（18/25），均高于水牛64.13%（143/223），差异有统计学意义（P＜0.05）；黄牛AKAV 样品阳性率为43.17%（180/417），西门塔尔牛为56.00%（14/25），均高于水牛28.93%（57/197），差异有统计学意义（P＜0.01）。结果表明，黄牛和西门塔尔牛2 种病原的感染状况较水牛严重。

表4 不同品种牛BTV 和AKAV 抗体检测结果统计

2.3.3 牛养殖规模 不同采样场点统计结果（表5）显示：养殖场牛BTV 样品阳性率为65.01%（444/683），散养户为67.10%（763/1 137），差异无统计学意义（P＞0.05）；养殖场牛AKAV样品阳性率为30.22%（152/503），散养户牛为33.85%（198/585），差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，这2 种病原的流行与养殖规模无关。

表5 不同采样场点的牛BTV 及AKAV 抗体检测结果统计

2.4 时间分布

不同采样时间统计结果（表6）显示：2022年5—8 月，牛BTV 样品阳性率整体呈升高趋势，其中7—8 月阳性率显著高于5—6 月（P＜0.01）；2022 年7—8 月采集的牛血清样品AKAV阳性率显著高于5—6 月（P＜0.01）。结果表明，2 种病原的流行有一定的季节分布特征，随气温升高，其流行率呈上升趋势。

表6 不同采样时间牛BTV 及AKAV 抗体检测结果统计

3 讨论

吸血库蠓叮咬家畜可传播BTV，因此BT 的分布与库蠓活动范围密切相关。由于全球气候变暖，加之媒介昆虫种类的增加和全球贸易的频繁往来，BTV 已经传播至中东地区以及亚洲其他国家和南美洲国家等，甚至蔓延至寒冷的北欧国家[7]。我国于1979 年在云南省师宗县首次发现BT 并成功分离到BTV 毒株。目前，我国31 个省（自治区、直辖市）已发现BTV 血清阳性动物，主要流行的致病血清型为BTV-1 型和BTV-16 型，尚未发现高致病性BTV-8 型。但随着全球贸易化的高速发展，高致病性 BTV-8 型随时可能传入我国。目前已发现 28 种BTV 血清型，这些血清型病毒分布于全球各地，各血清型间没有交叉保护性[8]。此外，BTV基因组为分节段的双链RNA（dsRNA），当宿主或者传播媒介感染了一种以上的毒株或者血清型时，病毒基因可发生重组，产生新的毒株[9]。

西双版纳州勐腊县地处云南省最南端的中缅边境地区，属热带、亚热带气候，雨量充沛，高温高湿，植被丰富，适宜蚊虫生存和繁殖。中缅两国通道众多，人员边贸往来频繁，常年存在走私猪、牛等动物及其制品（冻品）等违法行为，从境外低价收购未经检疫的牛，通过边境村庄的20 多个非法通道进入国内[10]。如此反复的活动，导致大量印度、孟加拉国、泰国、老挝、缅甸等国家的牛非法进入我国。据报道[4]，老挝反刍动物的BTV 抗体阳性率高达 96.7%，牛BTV 感染严重。同时，勐腊县的库蠓种类相较于云南省其他地方更为丰富，存在多种库蠓种群，比如琉球库蠓、短须库蠓、长斑库蠓和荒川库蠓等[11]。这可能是勐腊县牛BTV 抗体阳性率较高的原因之一。曾嘉庆等[4]对云南省边境7 市2018—2019 年、2021 年的牛血液样品进行了BTV 检测，发现抗体阳性率从11.86%上升至 2021 年的 23.22%。寇美玲等[12-13]对云南省边境12 县市2019 年、2020 年的牛血清样品进行BTV ELISA 检测，发现总阳性率分别为73.1%、77.9%。

富宁县牛AKAV 抗体样品阳性率最高，且抗体阳性率从2017 年的24%[3]升高至2022 年的50%，同时边境其他地区AKAV 抗体阳性率也呈现逐年升高的态势。对境内本地牛和入境牛的检测结果统计发现，入境牛BTV 抗体阳性率几乎是100%，明显高于本地牛（67.41%）；境内本地牛AKAV 抗体阳性率为36.29%明显高于入境牛（18.18%）。这可能有来源牛背景信息收集不完全的原因。但本研究的统计结果表明，接壤国家的BTV 流行较为严重，对我国本地牛群威胁较大。2020 年以来，受新型冠状病毒感染疫情影响，动物贸易停滞，在没有外来动物疫病传入风险的背景下，BTV 和AKAV 的抗体阳性率仍然升高，且养殖场和散养户等不同养殖规模牛群的抗体阳性率无显著差异，从某种程度上说明云南省边境地区的BTV和AKAV已广泛传播定殖。本研究发现，黄牛、西门塔尔牛和水牛均存在BTV 和AKAV 感染，但水牛的抗体阳性率与其他品种牛相比明显偏低，与寇美玲等[3，12]的检测结果一致。这其中可能有水牛样本较少的原因，牛品种与BTV 和AKAV 感染之间的关联性需要进一步加大样本量来验证。本研究发现，每年7—8 月的BTV 和AKAV 抗体阳性率显著高于5—6 月，进一步验证了BTV 和AKAV感染高发于高热高湿、蚊虫库蠓繁殖活跃的夏秋季节。

本研究结果表明：BTV 和AKAV 在云南省边境地区已广泛存在，其感染有加重趋势；病原通过境外牛传入国内的风险不断增加，防控形势较为严峻。为保障国内畜牧业的健康发展，需要继续加强监测，落实各项防控措施，控制BTV 和AKAV 的流行，同时严厉打击边境走私行为，阻断境外病原传入国内；因地制宜，实施免疫措施，强化生物安全，做好蚊虫控制；继续加强对BTV 和AKAV 的调查与研究，全面掌握这2 种病原的分布和流行特征，为预防与控制这2 种疫病奠定基础。