噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹的亚急性毒性效应

孙悦，赵宏晶，黄义棚，袁春营，崔青曼

（天津科技大学海洋与环境学院，天津 300457）

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹，是中国养殖的重要经济甲壳动物之一。稻田养蟹是以种植水稻以及养殖河蟹为目标，充分利用自然资源，挖掘稻田的生产潜力，实现稻蟹产量的双增收[1]。水稻种植过程中会使用一些农药，而对共生的中华绒螯蟹产生一定的影响。农药不仅破坏水体生态环境，还会影响水生生物的个体发育和繁殖，导致水生生物组织病理学的改变、脂质过氧化损伤和相关抗氧化酶活性改变等一系列生理变化，严重的还会致其死亡[2-7]。

新烟碱类杀虫剂是世界上使用最广泛的杀虫剂之一。它们对昆虫具有优先毒性，而对脊椎动物却低毒性[8]。噻虫嗪是一种全新结构的第二代烟碱类高效低毒杀虫剂，具有独特的作用机制和触杀、胃毒和内吸活性，适用于叶面、颗粒和种子的处理应用[9]。Minakshi 等[10]研究发现，噻虫嗪对双壳贝类的24 h、48 h、72 h 和96 h 的半致死浓度（LC50）分别为91.83 mg/L、61.91 mg/L、38.46 mg/L 和25.79 mg/L。在急性作用下，随暴露时间的延长，双壳贝类的氧耗率降低。这是由于沉积在呼吸表面的高黏液分泌干扰氧的扩散速率，减少氧的消耗，与急性作用相比，慢性作用下的耗氧率下降幅度较大[11]，表明噻虫嗪可能会损害淡水动物的氧化代谢。陈姣姣等[12]研究发现，噻虫嗪对中华蟾蜍（Bufo gargarizans）蝌蚪为低毒性，暴露于噻虫嗪96 h 后，中华蟾蜍蝌蚪的总超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性逐渐降低，丙二醛（MDA）含量明显升高，说明噻虫嗪会毒害中华蟾蜍蝌蚪的抗氧化防御系统。王召等[13]研究表明，噻虫嗪对鲫（Carassius auratus）幼鱼96 h 的LC50为28.95 mg/L。暴露于1 mg/L 和10 mg/L 噻虫嗪中96 h 后，鲫幼鱼肝胰腺和鳃组织中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性呈先上升后下降的趋势，表明噻虫嗪可导致鲫幼鱼抗氧化防御系统和神经系统的功能紊乱，影响鲫的正常发育。陈爱梅[14]研究发现，噻虫嗪能够造成斑马鱼（Danio rerio）脂质过氧化，损伤肝脏细胞的DNA，并且随时间和浓度增加，DNA 损伤程度增大。在稻田养蟹中，每平方米一般使用噻虫嗪1.10～1.64 μg/L，但很少有关于噻虫嗪对中华绒螯蟹影响的报道。为此，本研究采用半静态毒性试验法，探讨了噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹血淋巴细胞数量、肝胰腺、血淋巴和鳃免疫代谢指标及相关基因表达的影响，初步阐释噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹的亚急性毒性效应机理，为噻虫嗪在稻田养蟹上的合理使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

共采用中华绒螯蟹幼蟹样本480 只，平均壳长为（2.78±0.23）cm，平均体质量为（8.28±1.27）g，其他生物数据见表1，购自天津蟹源水产养殖有限公司。

表1 不同浓度组中华绒螯蟹幼蟹的生物学数据Tab.1 Biological data of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis in different concentration groups

TRIzolTMReagent 试剂盒、M-MLV、Random Primer，Invitrogen Corporation；Oligo dT、DTT、RNA 酶抑制剂、dNTPs 混合溶液、氯仿及乙醇购自北京索莱宝科技有限公司；异丙醇购自天津基准化学试剂有限公司；噻虫嗪（Thiamethoxam）购自上海源叶生物科技有限公司。

荧光定量PCR 仪，美国ABI 公司；MIKRO 200R 离心机，德国Hettich 科学仪器公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；全自动酶标仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验设计

设置噻虫嗪浓度分别为0 μg/L、90 μg/L、180 μg/L、360 μg/L、720 μg/L 和1 440 μg/L，每组10 只河蟹，实验前按照河蟹体质量3%～5%投喂饲料。实验容器为63 cm×43 cm×20 cm 的水族箱，验用水为充分曝气的自来水，饲养水温（23±2）℃。在噻虫嗪中暴露96 h，根据李燕华等[15]的公式法计算96 h的半致死浓度（LC50）和安全浓度（SC）：

其中xm是最大死亡组质量浓度的对数，d 是相邻两组质量浓度的对数差，p 是各组的死亡率。

在此基础上，设置噻虫嗪浓度分别为0 μg/L（对照组）、28.25 μg/L、56.5 μg/L、113 μg/L 和226 μg/L，每个实验组设3 个重复，每个重复20 只河蟹。实验持续21 d，期间按照河蟹体质量3%～5%投喂饲料，饲料组分见表2。实验第0 d、1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，每个重复各取2 只河蟹，冰浴上麻醉、酒精消毒河蟹体表，用1 mL 注射器从河蟹心脏处抽取血淋巴，用解剖剪剪开河蟹外壳，取其肝胰腺和鳃组织置于-20 ℃保存备用。

表2 实验饲料的组分Tab.2 Ingredient of the experimental diets（g/kg dry matter）

1.2.2 血淋巴细胞计数

从中华绒螯蟹幼蟹的心脏处抽取血淋巴与抗凝剂（每100 mL 2.05 g 葡萄糖，0.42 g 氯化钠，0.8 g柠檬酸钠）迅速混匀（1∶1），100 μL 血淋巴滴于血球计数板上，重复计数3 次。

1.2.3 免疫代谢相关指标测定

将每个浓度组第0 d、1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d取得的肝胰腺，与预冷的生理盐水按照1∶9 的配比冰浴匀浆，4 000 r/min 高速冷冻离心10 min，取上清液测定蛋白质含量和酶活性。蛋白质含量按照Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）说明书进行测定。肝胰腺中的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及血淋巴中的谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（AST）活性按照试剂盒（南京建成生物工程研究）说明书进行测定。血淋巴中的酚氧化酶活性按照Ashida[16]方法略有修改进行测定。

1.2.4 qRT-PCR 检测酚氧化酶（PO）和Na+-K+-ATPase 基因表达

中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺和鳃组织RNA 的提取按照Trizol 总RNA 抽提试剂盒说明书进行。β-action（内参）、酚氧化酶（PO）和Na+-K+-ATPase 的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列见表3。qRT-PCR 反应体系：10 μL 的SYBR Mix，0.4 μL 的50×ROX，0.5 μL 的上游引物，0.5 μL 的下游引物，7.6 μL 的双蒸水和1 μL 的样品cDNA 组成20 μL 的反应体系。qRT-PCR 反应程序：95 ℃下反应30s 进行预变性；95 ℃下反应5 s，60 ℃下反应34 s，40 个循环；溶解曲线：95 ℃下反应15 s，60 ℃下反应1 min，0.5 ℃/cycles，95 ℃反应15 s。反应结束后，保存并整理数据，利用2-△△ct法处理数据。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequences

1.3 数据统计与分析

测得的数据用平均值±标准差（X±SD）表示。采用SPSS 26.0 分析和处理数据。采用LSD 法进行多重比较，GraphPadPrism 8 绘制相关柱状图。

2 结果与分析

2.1 中华绒螯蟹幼蟹的半致死浓度和安全浓度

统计96 h 各浓度组中河蟹的死亡数量，得出96 h 半致死浓度（LC50）为452 μg/L，安全浓度（SC）为45.2 μg/L。

2.2 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹血淋巴细胞数量的影响

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，随着噻中嗪浓度的升高，河蟹血淋巴细胞数量先增加后降低；第14 d 和21 d，113 μg/L 和226 μg/L 噻虫嗪组河蟹的血淋巴细胞数量显著低于对照组（P＜0.05）。表明噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹血淋巴细胞的毒性效应较大（表4）。

表4 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹血淋巴细胞数量的影响（×106）Tab.4 Effect of thiamethoxam on the number of lymphocytes in juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.3 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺免疫指标的影响

2.3.1 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺SOD 活性的影响

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，随着噻虫嗪浓度的升高，河蟹肝胰腺SOD 活性先上升后下降；第1 d、4 d、7 d 和14 d，28.25 μg/L 噻虫嗪组河蟹SOD 活性显著高于对照组（P＜0.05），第7 d、14 d 和21 d，226 μg/L 组SOD 活性显著低于对照组（P＜0.05）（表5）。

表5 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺SOD 活性的影响/（U·mg-1prot）Tab.5 Effect of thiamethoxam on SOD activity in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.3.2 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺MDA 含量的影响

随着噻虫嗪浓度的升高，河蟹肝胰腺MDA 含量逐渐增加，第4 d、7 d、14 d 和21 d，56.5 μg/L、113 μg/L 和226 μg/L 噻虫嗪组河蟹肝胰腺MDA 含量显著高于对照组（P＜0.05）；除了第0 d 外，226 μg/L噻虫嗪组河蟹肝胰腺MDA 含量显著高于其他三个噻虫嗪组（P＜0.05）（表6）。

表6 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺MDA 含量的影响/（nmol·mg-1prot）Tab.6 Effect of thiamethoxam on MDA content in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.4 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹血淋巴免疫指标的影响

2.4.1 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹血淋巴GPT 活性的影响

随着噻虫嗪浓度的升高，河蟹血淋巴GPT 活性逐渐增加，第7 d、14 d 和21 d，113 μg/L 和226 μg/L噻虫嗪组河蟹血淋巴GPT 活性显著高于对照组（P＜0.05）；第7 d 和14 d，226 μg/L 噻虫嗪组河蟹血淋巴GPT 活性显著高于28.25 μg/L 和56.5 μg/L 噻虫嗪组（P＜0.05，表7）。可见，高浓度噻虫嗪可能破坏了中华绒螯蟹幼蟹的肝胰腺细胞结构，致使血淋巴中GPT 活性升高。

表7 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹血淋巴GPT 活性的影响/（U·L-1）Tab.7 Effect of thiamethoxam on GPT activity in hemolymph of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.4.2 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹血淋巴AST 活性的影响

随着噻虫嗪浓度的升高，河蟹血淋巴AST 活性逐渐增加，第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，113 μg/L 和226 μg/L 噻虫嗪组河蟹血淋巴AST 活性显著高于对照组（P＜0.05）；第7 d、14 d 和21 d，226 μg/L 噻虫嗪组河蟹血淋巴AST 活性显著高于28.25 μg/L 噻虫嗪组（P＜0.05，表8）。

2.4.3 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹血淋巴PO 活性的影响

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，随着噻虫嗪浓度的升高，河蟹血淋巴PO 活性先上升后下降，且以28.25 μg/L 组为最高，其中第1 d、4 d 和7 d，该组河蟹血淋巴PO 活性显著高于对照组（P＜0.05）。第7 d、14 d 和21 d，226 μg/L 噻虫嗪组河蟹血淋巴PO活性显著低于对照组（P＜0.05，表9）。

表9 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹血淋巴PO 活性的影响（/U·L-1）Tab.9 Effect of thiamethoxam on PO activity in hemolymph of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.5 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺po 和Na+/K+-ATPase 基因表达的影响

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，随着噻虫嗪浓度的升高，肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表达水平先上升后下降。除第0 d 外，28.25 μg/L 噻虫嗪组河蟹肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表达水平显著高于对照组（P＜0.05）；第4 d 和7 d，56.5 μg/L噻虫嗪组河蟹肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表达水平显著高于对照组（P＜0.05）；第14 d 和21 d，226 μg/L 噻虫嗪组河蟹肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表达水平显著低于其他四组（P＜0.05）（图1、图2）。

图1 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺po 基因表达的影响Fig.1 Effect of thiamethoxam on po gene expression level in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

图2 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺Na+/K+-ATPase 基因表达的影响Fig.2 Effect of thiamethoxam on Na +/K+-ATPase gene expression level in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.6 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹鳃组织PO 和Na+/K+-ATPase 基因表达的影响

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，随着噻虫嗪浓度的升高，河蟹鳃组织PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表达水平先上升后下降。第1 d、4 d 和7 d，28.25 μg/L和56.5 μg/L 噻虫嗪组河蟹鳃组织PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表达水平显著高于对照组（P＜0.05），第21 d，113 μg/L 和226 μg/L 噻虫嗪组河蟹鳃组织PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表达水平显著低于其他3 组（P＜0.05）（图3、图4）。

图3 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹鳃组织po 基因表达的影响Fig.3 Effect of thiamethoxam on po gene expression level in gill of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

图4 噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹鳃组织Na+/K+-ATPase 基因表达的影响Fig.4 Effect of thiamethoxam on Na +/K +-ATPase gene expression level in gill of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

3 讨论

血细胞作为细胞免疫的一部分在甲壳动物机体免疫系统中处于非常关键的地位[17]。血细胞数量可以间接反映出动物机体的健康状态及免疫应激能力，因此常作为衡量甲壳类动物免疫水平的指标之一[18]。高浓度草甘膦明显降低河蟹的血淋巴细胞数量[19]。本研究得到类似的结果，河蟹血淋巴细胞数量随噻虫嗪浓度的增加先上升后降低。究其原因，可能是低浓度噻虫嗪刺激中华绒螯蟹幼蟹机体的免疫系统，使其血细胞数量升高以应对应激胁迫，而高浓度噻虫嗪则会抑制中华绒螯蟹幼蟹的免疫功能，导致其血淋巴细胞数量下降。

甲壳类动物没有特异性免疫，其先天免疫主要由酚氧化酶和抗氧化酶等多种免疫因子组成[20]，其中，SOD 参与多种生理和代谢反应，特别是清除自由基和防止生物分子损伤机体，是抗氧化系统的关键酶。MDA 是脂质过氧化的代谢产物，这些指标的变化能反映机体受氧化损伤程度[21]。本研究发现，低浓度噻虫嗪能提高河蟹肝胰腺SOD 活性，高浓度噻虫嗪则抑制河蟹肝胰腺SOD 活性，与郝文静[22]的结果相一致。这可能是低浓度噻虫嗪胁迫能够提高中华绒螯蟹的防御能力，大量产生SOD 以清除超氧物阴离子自由基，而高浓度噻虫嗪胁迫下或暴露时间的延长，过量的自由基不能被及时分解，反过来会抑制SOD 的活性[23]。MDA 的含量可反映脂质的过氧化程度[24]。本研究中，随着噻虫嗪浓度的升高，河蟹肝胰腺MDA 含量逐渐增大，呈现出较好的浓度效应关系。中华绒螯蟹幼蟹受阿维菌素[22]和苯噻酰草胺[6]胁迫时，肝胰腺MDA 含量变化与本结果相似。28.25 μg/L 噻虫嗪组河蟹肝胰腺MDA 含量随时间增加先上升后下降，当MDA 含量较高时，肝胰腺SOD 仍具有较高活性，可能是肝胰腺脂质过氧化损伤对其抗氧化系统影响较小，说明中华绒螯蟹幼蟹对低于安全浓度的噻虫嗪有很好的适应性。

GPT 是一种参与机体蛋白质新陈代谢的酶，以肝细胞的线粒体中最多，当1%肝细胞被破坏时，GPT 会大量被释放进入血液，使血液中该酶活性显著升高。

AST 主要存在于肝细胞线粒体内，当肝脏发生严重坏死或破坏时，能引起谷草转氨酶在血清中浓度偏高。本研究发现，随着噻虫嗪浓度的升高，河蟹血淋巴GPT 和AST 活性逐渐增加，可能是高浓度噻虫嗪破坏了中华绒螯蟹幼蟹的肝胰腺细胞结构。同时发现，第4 d、7 d 和14 d，28.25 μg/L 噻虫嗪组河蟹血淋巴GPT 和AST 活性比对照组略有升高，第21 d，增加缓慢，可能是随着暴露时间的延长，河蟹机体逐渐适应了安全浓度下噻虫嗪的胁迫。

酚氧化酶（PO）是甲壳动物重要的非特异性血淋巴免疫因子之一。于萍[25]研究指出，在第7 d 和14 d，随着微塑料浓度的增加，中华绒螯蟹血淋巴中PO 活性呈现出先升后降的趋势。本研究也得到类似的结果，第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，随着噻虫嗪浓度的升高，河蟹血淋巴PO 活性出现先上升后下降的趋势。第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，随着噻虫嗪浓度的升高，河蟹肝胰腺和鳃组织PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表达水平也出现先上升后下降的趋势，与郝文静[22]的结果相一致。可能是低浓度噻虫嗪对河蟹肝胰腺和鳃组织po 基因的表达有促进作用，高浓度噻虫嗪则有抑制作用。Na+/K+-ATPase 可以水解ATP 获得能量，利用该能量进行Na+和K+逆浓度梯度穿过质膜的转运，维持细胞内外液的渗透差，在机体的代谢中具有重要作用。研究发现，低浓度噻虫嗪胁迫下，Na+/K+-ATPase 的表达量升高，说明噻虫嗪刺激中华绒螯蟹幼蟹的渗透压调节，以抵御噻虫嗪带来的损害，而在高浓度和长时间暴露下，中华绒螯蟹机体的抗氧化系统和结构等受到损伤，肝胰腺细胞受到破坏，其功能受到影响，导致Na+/K+-ATPase 表达量降低。

综上所述，高浓度的噻虫嗪对中华绒螯蟹幼蟹的抗氧化酶活性、血淋巴细胞数量和PO 及Na+/K+-ATPase 的基因表达有较大影响，低浓度的噻虫嗪对于中华绒螯蟹幼蟹的抗氧化和代谢系统具有刺激作用。基于本实验结果，建议稻田养蟹中噻虫嗪使用浓度应不超过45.2 μg/L。