三种复合微生态制剂联用在稻-蟹共生系统中的应用效果

张光晨，王洋,2，白东清,2，邱金来

（1.天津农学院水产学院，天津 300392；2.天津市水产生态及养殖重点试验室，天津 300392；3.天津三缘宝地农业科技有限公司，天津 300000）

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹，是最受国人喜爱的淡水蟹。据中国渔业年鉴记录，我国河蟹年产量自2017—2019 年稳步攀升，到2020 年达到775 887 t[1-4]。稻-蟹共生作为一种新兴的生态化养蟹模式，经济效益高[5]，环境友好，发展速度较快[6]。稻-蟹模式用药少或者不用药，较单独养殖模式相比，对疾病防控的要求更高[7]。益生菌制剂作为一种具有替抗潜能的物质，是水产养殖中常用的促生长、免疫调节及抗病制剂。Ayisi 等[8]综述了微生态制剂在几种海蟹中的应用效果，包括提升免疫力、改善水质、补充消化酶，以及降低发病率。褚兰璐等[9]发现，EM菌能够增强中华绒螯蟹的抗氧化能力和免疫能力。赵亮等[10]在全封闭育苗系统中使用光合细菌，明显提高了中华绒螯蟹的成活率，使水中氨氮及亚硝态氮浓度降低40%以上。王典[11]使用“龙源”益生菌液使稻田养蟹增产，成活率提高。姚东瑞等[12]在太湖的中华绒螯蟹池塘内单独或联合使用多种微生态制剂，使化学需氧量、固体悬浮物、总磷和氨态氮含量降低了40%以上，使湖水达到了排放标准。肖玉冰等[13]在中华绒螯蟹养殖中施加EM 菌，降低了水体氨氮、化学耗氧量、亚硝态氮和总磷含量，提高了蟹的成活率。Wan 等[14]以复合菌剂及低聚果糖饲喂中华绒螯蟹幼蟹，较单纯使用益生菌，取得了更好地促生长和免疫的效果。然而，目前复合微生态制剂在稻田蟹养殖中的应用尚不成熟，研究多聚焦单一复合微生态制剂对中华绒螯蟹的影响，在养殖生产中，发现三种复合微生态制剂联用，可有效降低养殖损失，提升产品品质，因此亟需开展对复合微生态制剂联用效果的科学评价。

本研究将三种复合微生态制剂联用，饲喂在稻田中养殖的中华绒螯蟹5 个月，最终收获时检测其生长指标、营养品质、感官品质及环境微生物组成。研究结果可为三种复合微生态制剂联用在稻-蟹共生模式中的应用及“稻蟹益生菌”的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 中华绒螯蟹养殖试验

在天津三缘宝地农业科技有限公司稻田蟹养殖基地，取6 块面积约80 m2的稻田进行养殖试验，四周围起高50 cm 的塑料布。5 月中旬投放同批、大小相近、活力较好的“光合1 号”中华绒螯蟹幼蟹，密度为按6 g·m-2。其中3 个平行组稻田投喂中华绒螯蟹全价饲料[为盘锦大洼县佳鑫饲料厂蟹乐河蟹配合饲料，饲料成分为玉米、豆粕、鱼粉、菜粕、次粉、磷酸氢钙、维生素（A、D3、E、B1 等）、微量元素（硫酸亚铁、硫酸铜等）、脱壳素等]，作为对照组；另3 块平行试验稻田则投喂拌有三种复合微生态制剂的全价饲料，作为微生态制剂组，其余操作两组均无区别。试验中，每日8：00、18：00 在环沟的浅水处投喂2 次，日投饲率8%；每3 天上午换水三分之一，温差在3 以内；为保证蟹顺利蜕壳，每15 d 施用一次葡萄糖离子钙（奥立安（湖北）生物工程有限公司）。养殖5 个月时采样，检测生长和营养品质指标。

1.2 试验用复合微生态制剂

试验中所用的三种复合微生态制剂购自厦门利洋水产科技有限公司。包括：①水产专用复合预混饲料“营养快线”氨基酸电解质多维（烟酰胺、泛酸钙、蛋氨酸、氯化钾、葡萄糖组成，条码：06951259640131）；②混合型饲料添加剂复合微生物“利多精”（含1.0×109CFU·g-1的枯草芽孢杆菌和破壁花粉，条码：06951259616006）；③水产用复合预混饲料“LY-生命素”（主要成分为低聚壳聚糖、复合维生素、DL-蛋氨酸、泛酸钙、啤酒酵母粉，条码：06951259612251），复合微生态制剂具体原料组成及用量如表1 所示，每周使用一次。

表1 复合微生态制剂成分表及用量Tab.1 The ingredients and dosage of the composite probiotics

1.3 中华绒螯蟹品质指标的测定

中华绒螯蟹的品质指标主要包括生长指标（蟹重、壳长、壳宽和壳厚）、体成分指标、感官品质和熟蟹色泽。从对照组和微生态制剂组各随机取60 只蟹，测量生长指标后，从中随机取出5 只测定蟹肉及肝胰腺和性腺混合物（蟹黄）的营养指标，分别采用冷冻干燥法[15]、凯氏定氮法[16]和索氏抽提法[17]分别测定水分、粗蛋白及粗脂肪含量。从剩余的蟹中随机取雌雄蟹各10 只，蒸10 min 后感官评价并测定蟹壳色泽。感官评价组成员为7 名经过感官试验培训的师生，评价标准参考朱塽等[18]的文献。通过色差仪（日本柯尼卡美能达CR-400）测定蒸熟蟹的蟹壳、蟹肉及蟹黄的L*（亮度）、a*（红度）和b*（黄度）值。

1.4 中华绒螯蟹养殖稻田微生物多样性的分析

从对照组和微生态制剂组稻田边缘取水和底泥，低温运回实验室。水样用双层纱布滤除杂质，再分别用0.45 μm 和0.22 μm 滤膜抽滤，以无菌生理盐水洗涤所有滤膜，离心收集盐水中的细菌；底泥样本装入无菌自封袋混合均匀；最终将同组3 块田的样本合并为一个混合样本。低温送往北京奥维森基因科技有限公司进行DNA 提取和高通量测序。具体测序流程为：首先提取各样本细菌的总DNA，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA，然后通过 TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase 对所提DNA 进行PCR 扩增，每个样本3个重复。将同一样本的PCR 产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳后使用AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒（AXYGEN 公司）切胶并回收PCR 产物。回收的PCR 产物通过QuantiFluorTM-ST 蓝色荧光定量系统（Promega 公司）进行检测定量，并按照测序量要求进行混合。构建Miseq 文库构建，并用MiseqPE300 测序。

1.5 数据处理

利用SPSS 24 软件对中华绒螯蟹品质数据进行T 检验，α=0.05。感官评价雷达图通过Origin 2018 软件绘制。微生物组数据采用奥维森云平台分析处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 三种复合微生态制剂联用对中华绒螯蟹生长指标的影响

收获时对照组蟹的体质量为（70.39±14.83）g，微生态制剂组为（81.86±25.80）g，二者无统计检验差异（表2）。对照组蟹与微生态制剂组蟹的体长，体宽和厚度均无显著差异（P＞0.05）。

表2 三种复合微生态制剂联用对中华绒螯蟹生长指标的影响Tab.2 Effects of combined use of three complex probiotics on growth indices of Chinese mitten handed crab

2.2 饲喂复合微生态制剂对中华绒螯蟹蟹肉及肝胰腺和性腺混合物营养成分的影响

表3 列出了对照组和饲喂复合微生态制剂组中华绒螯蟹蟹肉及肝胰腺与性腺混合物的营养成分。对照组蟹肉的水分含量为（78.3±0.8）%，粗蛋白占干重的（82.9±1.7）%；饲喂微生态制剂对蟹肉水分和粗蛋白的含量没有显著影响（P＞0.05）。对照组蟹的肝胰腺与性腺混合物水分含量为（72.2±1.5）%，粗蛋白占干重的（44.5±1.9）%，粗脂肪占（46.9±1.9）%。饲喂微生态制剂对肝胰腺与性腺混合物的水分、粗蛋白和粗脂肪含量没有显著影响（P＞0.05）。

表3 三种复合微生态制剂联用对中华绒螯蟹蟹肉和肝胰腺与性腺混合物营养成分的影响Tab.3 Effects of combined use of three complex probiotics on the nutrient composition of meat,hepatopancreas and gonad in Chinese mitten handed crab

2.3 感官评价

感官评分结果显示（图1），与对照组相比，饲喂复合微生态制剂组中华绒螯蟹的蟹壳色泽、肉质、肉的鲜甜度、蟹香味及肥满度评分显著增加（P＜0.05），各项指标的评分增加幅度分别为19.4%、25.0%、21.6%、25.0%和21.6%。

图1 三种复合微生态制剂联用对中华绒螯蟹感官评分的影响Fig.1 Effects of combined use of three complex probiotics on sensory scores of Chinese mitten handed crab

2.4 三种复合微生态制剂联用对中华绒螯蟹熟蟹色泽的影响

表4 为蒸煮后中华绒螯蟹熟蟹蟹壳、蟹黄（肝胰腺与性腺混合物）及蟹肉的亮度（L*）、红度（a*）和黄度（b*）。微生态制剂组蟹壳呈褐红色，红度值（25.59±3.04）显著高于对照组（20.43±3.10）（P＜0.05），亮度和黄度与对照组没有显著差异。微生态制剂组的蟹黄色泽橘红，其红度（17.72±2.19）和亮度（51.17±3.39）显著高于对照组（P＜0.05），黄度与对照组没有差异。两组蟹肉的色泽指标没有显著差异（P＞0.05）。

表4 三种复合微生态制剂联用对中华绒螯蟹蒸煮后色泽的影响Tab.4 Effects of combined use of three complex probiotics on the color of steamed Chinese mitten handed crab

2.5 对中华绒螯蟹稻田养殖环境中微生物多样性的影响

2.5.1 高通量测序质量

高通量测序表明，对照组和微生态制剂组中华绒螯蟹养殖稻田中泥和水样中，测得有效序列共186 995 条，其中对照组泥样33 592 条、水样38 848条；微生态制剂组泥样24 521 条、水样90 034 条。其中99.95%的有效序列长度在400～440 bp 范围（图2-A），各样本的多样性及新发现物种数随样本测序量的升高逐渐趋于平缓（图2-B），表明本次测序质量好，深度足够。

2.5.2 物种维恩图

中华绒螯蟹稻田泥和水样微生物OTU 数量如图3 所示，各样本共有OTU 数192 个，对照组泥样的独有OTU 数最多，为228 个，而微生态制剂组水样独有OTU 数为46 个，为四个样本中最少。微生态制剂组各样本独有OTU 数均低于相同取样部位的对照组样本。

图3 中华绒螯蟹养殖稻田泥和水样的微生物OTU 维恩图Fig.3 The microbiological Venn diagram of mud and water in the paddy fields with Chinese mitten crab farming

2.5.3 α 多样性情况

中华绒螯蟹稻田泥和水样微生物α 多样性如表5 所示。与对照组相比，微生态制剂组的水样和泥样的PD whole tree 指数、Shannon 指数、Chao1 指数和观测物种数量（observed species）指数更低。表明使用微生态制剂降低了中华绒螯蟹稻田水样和泥样的微生物α 多样性。

表5 中华绒螯蟹养殖稻田泥和水样的微生物α 多样性Tab.5 Microbial alpha diversity in mud and water in the Chinese mitten handed crab farming paddy field

2.5.4 中华绒螯蟹养殖稻田微生物物种组成

中华绒螯蟹养殖稻田泥和水样微生物组成如图4 所示。各样本组门水平上均主要由变形菌门、拟杆菌门、蓝细菌门、放线菌门等12 个门组成（在任意一个样本中相对丰度均大于1%），其中变形菌门是在各样本中均为最优势门。除变形菌门外，对照组中水样中拟杆菌门（13.89%）、蓝细菌门（19.34%）和放线菌门（12.49%）是次优势微生物（相对丰度＞8%），泥样中的次优势微生物门为酸杆菌门（20.80%）和绿弯菌门（11.06%）；微生态制剂组，水样的拟杆菌门（17.84%）和放线菌门（8.67%）为次优势菌门，而泥样中，则为拟杆菌门（10.76%）、厚壁菌门（10.39%）、酸杆菌门（9.22%）和蓝绿菌门（8.88%）。

图4 中华绒螯蟹养殖稻田泥和水样的微生物组成（A 门水平，B 科水平）Fig.4 The microbial composition in mud and water in the Chinese mitten handed crab farming paddy field（A: phylum,B:family）

在科水平上，对照组（23.96%）和微生态制剂组（30.28%）水样中丛毛单胞菌科均占比最高。与对照组相比，联用三种复合微生态制剂使鱼孢菌科和隐鞭藻科相对丰度降低，普雷沃菌科（7.33%）上升为次优势科。对照组泥样，大量微生物无法鉴定（unidentified），其次为Blastocatellaceae_Subgroup_4（4.85%），而其他微生物所占比例较低，微生态制剂组泥样中无法分科的黄单胞菌目微生物（7.98%）和Family I（5.39%）成为优势。与水稻细菌性穗枯病相关的伯克霍尔德氏菌科在用微生态制剂后水样和泥样中的相对丰度均增长。

2.5.5 β 多样性情况

图5 显示了中华绒螯蟹养殖稻田泥和水样微生物群落的相似性。第1 主成分（PC1）特征值的贡献率为65.33%，第2 主成分特征值的贡献率为19.77%，两者之和占总变异的85.1%，说明这两个主成分可代表中华绒螯蟹养殖稻田的微生物多样性。图5 中各样本点间的距离代表样本间的相似性情况，因此可知这四组中华绒螯蟹稻田环境样本间微生物群落差异较大。

图5 中华绒螯蟹养殖稻田泥和水样的微生物主成分分析Fig.5 Principal component analysis of the microbial composition in mud and water in the Chinese mitten handed crab farming paddy field

3 讨论

3.1 三种复合微生态制剂联用对中华绒螯蟹感官 品质的影响

本研究证明，联用三种复合微生态制剂能够显著提高稻田蟹熟蟹的感官品质。本试验中联用三种复合微生态制剂可以提高中华绒螯蟹色泽，使其变得更加褐红、油亮，具有更少的杂斑。蟹的色泽与类胡萝卜素的种类和含量有关[19]。只能通过食物链和代谢[20,21]获得。枯草芽孢杆菌可以提升凡纳滨对虾（Litopenaeus Vannamei）组织中的虾青素浓度，改变体色[22]。李立新等[23]报道，复合维生素有促进雨生血球藻（Haematococcus Pluvialis）虾青素的积累。水产动物体内维生素A 和维生素E 的含量也会影响胡萝卜素的合成[24]。联用三种复合微生态制剂后，中华绒螯蟹蟹肉口感更佳，肉质更细腻、富有弹性，多种维生素可以影响肉质[25]。复合微生态制剂联用还使蟹的口味更加清甜，闻起来有更浓郁的蟹香味。这些味道上的变化与蟹中的呈味非挥发性物质和挥发性化合物有关[26]，如谷氨酸、5’-肌苷一磷酸二钠、5’-腺苷一磷酸二钠[27]，醛类等[28]。因此，有必要进一步关注呈味物质的含量。本研究发现，联用复合微生态制剂使蟹重和壳长增加，蟹黄和蟹膏更加丰满。重量和肥满度是影响中华绒螯蟹价格的重要品质，未来可继续开展联用复合微生态制剂提高重量和肥满度的机制研究，为稻田蟹用复合微生态制剂的应用和研发提供依据。

3.2 三种复合微生态制剂联用对稻-蟹共生环境微生物多样性的影响

本研究发现，联用三种复合微生态制剂降低了中华绒螯蟹稻田环境的细菌丰度，也改变了其组成。值得注意的是，复合微生态制剂的联用使丛毛单胞菌科的相对丰度显著增加。丛毛单胞菌科中的许多微生物见于水、土壤和污染环境中，具有降解复杂有机物[29]和除磷的功能[30]，还可以作为硫酸盐还原剂[31]和降氮剂[32]，因此提高丛毛单胞菌的相对丰度对养殖水体水质净化有积极作用。同时联用三种复合微生态制剂也明显提高了黄单胞菌目和伯克霍尔德氏菌科的相对丰度。黄单胞菌目-稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）是引起稻-蟹共生中的主产品-水稻的病原体。它能够引起作为水稻最严重的病害之一的水稻白叶枯病和重要性日益显现的细菌性条斑病，使水稻品质下降和减产[33]。伯克霍尔德氏菌科-Burkholderia glumae 是全球水稻越来越严峻的细菌性穗枯病的病原菌[34]，使用微生态制剂后水样和泥样中的伯克霍尔德氏菌科的相对丰度提高，提示有产生细菌性穗枯病的可能。所以后续有必要深入分析联用三种复合微生态制剂对系统中水稻患细菌性疾病的风险。

本研究未检测稻田蟹的代谢能力、免疫水平、肠道微生物组、稻田水质、水稻相关生理特性及试验中联用的复合微生态制剂中每一种物质的作用效应以及共同作用机制。后续将深入开展相关试验，有助于全面评估本研究所联用的复合微生态制剂在中华绒螯蟹稻-蟹共生养殖模式中使用的可行性。

3.3 结论

本研究证明了在稻-蟹共生模式下饲喂复合微生态制剂可提升中华绒螯蟹蟹壳和肝胰腺色泽与蟹的感官指标，有助于提高“稻-蟹共生”中华绒螯蟹的价值和品质。联用三种复合微生态制剂改变了中华绒螯蟹养殖稻田环境中微生物群落结构，提升了氮、磷、硫降解菌的比例，但使潜在水稻病原细菌比例略有增加。继续深入分析蟹的代谢和免疫水平，水稻的生理和发病风险，可为联用复合微生态制剂在稻-蟹共生模式中的使用提供更全面的理论支持。