安徽部分地区湖羊呼吸道病原微生物鉴定

黄媛媛,谭美玲,薄瑞红,余承波,张美诗,杨长根,王 福,赵家喜,余杞强,阮祥春,6*

(1.安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥 230036;2.望江县小月山农业发展有限公司,安徽望江 246200;3.霍山县畜牧产业发展中心,安徽霍山 237200;4.望江畜牧兽医技术推广中心,安徽望江 246200;5.宿松县农业综合技术推广服务中心,安徽宿松 246500;6.兽医病理生物学与疫病防控省级重点实验室,安徽合肥 230036)

湖羊主要产于浙江嘉兴和太湖地区,成年公羊体重40～50 kg,母羊35～45 kg,耐热、耐湿,惯舍饲,成熟早,肉质好,母羊终年发情,繁殖力高。近年来,随着长三角地区产业转移速度的加快和安徽省皖江城市带承接产业转移示范区的建设,长三角地区湖羊养殖快速向安徽省内转移[1],湖羊在安徽省的养殖数量和规模随之不断增加。

舍饲是湖羊的基本饲养方式。集约化养殖使得羊群密度增加,因饲养管理水平和防疫措施不到位,导致羊病的发生和流行呈上升趋势。其中,以羊的呼吸道疾病尤为常见。羊呼吸道疾病的发生通常是由多种细菌引起的,常见的有多杀性巴氏杆菌、链球菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯氏菌、溶血性曼氏体、卵形肺炎梅氏杆菌等。它们主要存在于羊的上呼吸道,在机体感染其他呼吸道致病菌后侵入下呼吸道,引起羊的慢性和持续性的咳嗽、呼吸困难、流涕和打喷嚏,部分可见急性纤维素性肺炎等主要临床症状,此外还伴有不同类型的发热、精神沉郁、饮食欲减退或废绝、生长缓慢等,严重者往往还存在混合感染和继发感染现象,使得疾病呈现复杂化[2-6]。

为了解湖羊呼吸道病原微生物的种类及分布情况,笔者在安徽省霍山县、望江县和宿松县的4个羊场共采集湖羊上呼吸道鼻拭子样本598份,进行细菌分离纯化及鉴定,为湖羊呼吸道疾病的临床诊断和防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集2021年12月,在安徽省霍山县、望江县和宿松县的4个不同规模化养殖场,按照90%的置信区间,共采集4—8月龄湖羊鼻拭子样本598份。样本保存于装有1 mL胎牛血清LB肉汤的2 mL灭菌离心管中,2～8 ℃保存备用。

1.2 病原菌分离纯化及形态学鉴定用接种环于离心管中蘸取胎牛血清LB肉汤,采用四区划线法接种于胎牛血清LB营养琼脂和脑心浸液琼脂培养基,挑选单菌落纯化,于恒温培养箱中37 ℃培养24 h,观察记录菌落生长情况。待菌落长成,在超净台中挑取单菌落,用无菌水稀释,在载玻片上进行涂片、干燥、固定,然后进行革兰氏染色,镜检,观察细菌形态特征。

1.3 病原菌分子鉴定用接种环挑取形态学无法鉴别的病原菌菌落于50 μL Lysis Buffer 中,80 ℃恒温水浴锅加热15 min,DNA提取完后保存于-20 ℃中备用。将提取的DNA用16S rDNA通用引物(27F:5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3;1492R:5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)进行PCR扩增目标序列。采用25 μL 反应体系,即上游引物、下游引物各1 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)9.5 μL,ddH2O 12.5 μL,DNA 模板1 μL。反应条件为94 ℃ 3 min预变性,94 ℃ 45 s变性,60 ℃ 45 s退火,72 ℃ 72 s延伸,35个循环;72 ℃ 7 min后延伸。取10 L PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,检测DNA片段长度,并在凝胶成像系统中观察条带大小,确认质量合格、无明显杂带后,将经过PCR扩增的产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序并拼接[5]。测得的序列结果在NCBI网站上的“Blast”GenBank数据库比对,获取与所测序列相似度高的序列,判断16S rDNA基因鉴定结果。

1.4 系统进化树的构建取得双向测序拼接后的完整病原菌DNA序列后,导入NCBI网站上的“Blast”数据库中进行比对,设置参数Identify>95,再下载Identify最高的前12条16S rDNA序列,并利用MEGA7.0版本软件进行序列多重比对后,采用MEGA7.0-Phylogeny绘制Neighbor-Joining系统进化树[7-8]。

2 结果与分析

2.1 病原菌形态学鉴定结果采集的598份鼻拭子样本中,通过形态学鉴定的菌株共391株,分别为葡萄球菌属211株、大肠埃希氏菌属102株、芽孢杆菌属76株、多杀性巴氏杆菌和链球菌各1株。

2.2 病原菌分子学鉴定结果

2.2.1分离菌株16S rDNA扩增结果。对形态学鉴定未知的菌株,PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示,扩增获得的目标片段大小均约为1 500 bp,其中WJ61和HS100样品菌株的电泳扩增结果见图1。

注:M为DNA Marker,1为WJ61菌株,2为HS100菌株。Note:M is DNA Marker,1 is WJ61 strain,and 2 is HS100 strain.

2.2.2未知菌株系统进化树构建与同源性比对。以WJ61菌株为例,获得拼接过的完整细菌序列后,提交至NCBI“Blast”数据库中,由MEGA7.0软件制作系统进化树。菌株WJ61的16S rDNA序列与红沙雷氏菌JCM1240(登录号为:NR-024644.1)、DSM4480(登录号为:NR-114716.1)和NBRC103169(登录号为:NR-114232.1)在同一侧支上,同源性达100%,亲缘关系最为接近。综合其革兰氏染色和测序结果,判定菌株WJ61为红沙雷氏菌(图2)。剩余10株未知菌株的16S rDNA序列比对结果见表1。

表1 未知菌株基因序列比对结果

图2 WJ61菌株系统进化树构建Fig.2 Phylogenetic tree construction of WJ61 strain

对未知菌株进行16S rDNA基因PCR扩增,再经测序比对以及革兰氏染色,共鉴定出11种不同菌株(细菌革兰氏染色图见图3),分别为鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、红沙雷氏菌、莱克勒西亚菌、铜绿假单孢菌、乳酸明串珠菌、奇异变形杆菌、普罗维登斯尼比亚菌、蒙氏肠球菌、河生雷特勒氏菌、假单孢菌。

2.3 病原菌检出结果采集的598份湖羊鼻拭子病原菌检出结果见表2。由表2可知,598份鼻拭子样本中共检出445株菌株,分属15个种属,分别为葡萄球菌属、肠球菌属、芽孢杆菌属、假单孢菌属、不动杆菌属、肠杆菌属、巴氏杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、变形杆菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、普罗维登西亚菌属、莱克勒西亚菌属和Lelliottia属。检出菌株数最多的为葡萄球菌属,其次依次为肠杆菌属和芽孢杆菌属。葡萄球菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌、蒙氏肠球菌、河生雷特勒氏菌、红沙雷氏菌、乳酸明串珠菌、莱克勒西亚菌和铜绿假单孢菌均属于条件致病菌。巴氏杆菌(1株)、链球菌(1株)、鲍曼不动杆菌(5株)属于羊呼吸道致病菌。

表2 4个湖羊场呼吸道微生物分布

从区域分布情况看,霍山县241份样本中共检出223株菌株(检出率92.53%),分属9种菌属;望江县华阳镇180份样本中共检出74株菌株(检出率41.11%),分属6种菌属;望江县鸭滩镇83份样本中共检出54株菌株(检出率65.06%),分属7种菌属;宿松县94份样本中共检出94株菌株(检出率100%),分属6种菌属。其中,霍山县样本中呼吸道致病菌检出率2.24%,宿松县样本中呼吸道致病菌检出率2.13%,望江县2个羊场的样本中均未检出上述呼吸道致病菌。

3 结论与讨论

湖羊呼吸道疾病的发生通常是由多种细菌引起的。多杀性巴氏杆菌、溶血性链球菌、鲍曼不动杆菌以及曼氏小体等是引起湖羊呼吸道疾病发生的主要致病菌,且与湖羊呼吸道疾病的持续感染有关[9]。

该试验按照90%的置信区间,从安徽省霍山县、望江县和宿松县的4个湖羊养殖场共采集598份鼻拭子样本,经细菌分离纯化、鉴定,共检出445株菌株,分属15个种属,分别为葡萄球菌属、肠球菌属、芽孢杆菌属、假单孢菌属、不动杆菌属、肠杆菌属、巴氏杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、变形杆菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、普罗维登西亚菌属、莱克勒西亚菌属和Lelliottia属。检出菌株数最多的为葡萄球菌属,其次依次为肠杆菌属和芽孢杆菌属。葡萄球菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌、蒙氏肠球菌、河生雷特勒氏菌、红沙雷氏菌、乳酸明串珠菌株、莱克勒西亚菌和铜绿假单孢菌均属于条件致病菌。巴氏杆菌(1株)、链球菌(1株)、鲍曼不动杆菌(5株)属于羊呼吸道致病菌。从区域分布看,霍山县241份样本中共检出223株菌株(检出率92.53%),分属9种菌属;望江县华阳镇180份样本中共检出74株菌株(检出率41.11%),分属6种菌属;望江县鸭滩镇83份样本中共检出54株菌株(检出率65.06%),分属7种菌属;宿松县94份样本中共检出94株菌株(检出率100%),分属6种菌属。其中,霍山县样本呼吸道致病菌检出率最高(2.24%),其次为宿松县(2.13%),望江县2个羊场的样本均未检出上述呼吸道致病菌菌株。由此可见,虽然这4个羊场的样本中呼吸道致病菌检出率较低,但葡萄球菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌和铜绿假单孢菌等条件致病菌均有较高的检出率。条件致病菌虽不能直接导致呼吸道疾病的发生,但在外界环境改变或机体自身免疫力下降时,容易使得羊群产生其他疾病或感染,而在这个过程中就有可能诱发羊群呼吸道疾病的发生。

何川川[10]调查发现,新疆部分地区健康羊呼吸系统优势菌种分别为粪肠球菌、乳酸乳杆菌、羊莫拉菌、溶血不动杆菌、链球菌和溶血性曼氏杆菌等。韩林梅[11]对广西6个地区的73份样品进行检测发现,广西部分地区主要以肺炎支原体、肺炎克雷伯氏菌和化脓隐秘杆菌等的感染为主。该试验采集的598份样本中,优势菌株主要为葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌等条件致病菌,霍山县样本中还检出了链球菌、蒙氏肠球菌、铜绿假单孢菌、鲍曼不动杆菌、河生雷特勒氏菌和多杀性巴氏杆菌;望江县样本中检出了乳酸明串珠菌、红沙雷氏菌、普罗维登斯尼比亚菌和奇异变形菌;宿松县样本中检出了鲍曼不动杆菌和莱克勒西亚属。说明湖羊呼吸道病原微生物种类存在一定的地区性差异。

该研究结果表明,安徽省霍山县、望江县和宿松县的湖羊呼吸道病原微生物中优势菌株主要为葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌等条件致病菌,巴氏杆菌、链球菌、鲍曼不动杆菌等致病菌检出率较低。所以,了解该区域内的湖羊呼吸道病原微生物的种类和分布情况,对于合理选择敏感药物来进行科学防治具有指导意义。