中草药复方制剂对乌鳢诺卡氏菌病药效研究

朱宇嘉，朱盛山

（广州市普精生物科技有限公司，广东 广州 510663）

乌鳢（Channa argus）是我国主要养殖品种之一，根据《2021 中国渔业统计年鉴》，我国2020 年乌鳢养殖年产量已达50 万t，产量年增幅10%。近年来，诺卡氏菌病频发，成为乌鳢养殖成功率不断下降的主要因素之一。诺卡氏菌病在乌鳢育苗及成鱼养殖阶段均有发生，每年4—11 月为高发期，发病率可达60%，死亡率可达80%，严重威胁乌鳢的健康养殖。导致诺卡氏菌病的主要菌种包括诺卡氏菌、星诺卡氏菌和杀鲑诺卡氏菌，其中诺卡氏菌是较为普遍的一种[1-2]。被诺卡氏菌病感染后，产生的主要症状包括：厌食、游泳迟缓、鳍部出血、白色结节（肉芽肿）、体表（包括鳃部、皮下等）溃疡出血（俗称烂身）等[2-10]。

Wang 等[3]通过注射荧光标记的诺卡氏菌感染四带无须魮（Puntius tetrazona），发现细菌可随血液循环扩散到心、肝、肾等组织，引起吞噬细胞聚集、死亡，进而形成肉芽肿即俗称白色结节。Maekawa等[11]研究发现，诺卡氏菌感染形成肉芽肿后，在肉芽肿中心出现坏死以及细菌（诺卡氏菌）聚集，一般用药难以进入肉芽肿内部。夏立群等[12]在诺卡氏菌体内发现动力蛋白调节蛋白robl/LC7，凋亡检测结果显示，诺卡氏菌robl/LC7 可能参与细胞凋亡调控，这有利于其在巨噬细胞内生存及免疫逃避。诺卡氏菌感染产生的结节以及其自身具备的免疫逃避等特点，导致诺卡氏菌病难以治疗。养殖中，常用混合抗生素治疗，但效果甚微[10]。联合国粮食及农业组织（FAO）在报告中指出，抗生素难以防治诺卡氏菌病[13]。

1 材料与方法

1.1 材料

试验乌鳢来源于中山市容海水产养殖有限公司。体质量为（205±10）g，诺卡氏菌及其他试剂信息见表1。

表1 试验使用材料信息①

1.2 仪器

试验使用的仪器及相关参数见表2。

表2 试验使用仪器信息

1.3 菌种复苏与菌液制备

从超低温冰箱中取出冻存的诺卡氏菌株，使用经火焰消毒后的接种环，挑取少量诺卡氏菌于脑心浸液肉汤培养基中，28 ℃振摇培养7 d。以空白脑心浸液肉汤培养基作为空白对照液调零，在波长600 nm 处测定菌悬液吸光值（OD），计算含菌数，并稀释成1×109cfu/mL 的菌悬液。

1.4 最低抑菌浓度（MIC）测定试验

采用2 倍稀释平皿培养法测定MIC[14]。将受试HNK、穿梅三黄散、大黄流浸膏，用适宜溶剂配制成1 g/mL 的药液，高压灭菌后，按2 倍递减浓度稀释，共配制成11 个浓度梯度（250.00，125.00，62.50，31.30，15 .60，7.80，3.00，1.90，0.98，0.49 和0.24 g/L）的药物稀释液。按无菌操作吸取药液和菌悬液各100 μL，于96 孔板第1~11 孔中，第12 孔加入配制溶剂和菌悬液各100 μL，作阴性对照，置恒温培养箱中28 ℃培养7 d。肉眼观察，无菌生长的最低浓度为该试菌的MIC。

1.5 药效试验

1.5.1 攻毒试验

试验共设置5 个感染组（其诺卡氏菌株菌液浓度分别为2×105，2×106，2×107，2×108和2×109cfu/mL），1 个空白对照组。每组放养乌鳢20 尾，于1 m3水族箱中暂养1 周后开始攻毒试验。感染组按对应菌液浓度，在乌鳢腹腔注射，剂量为0.5 mL/尾，对照组注射0.5 mL 生理盐水。攻毒后，继续饲养14 d，暂养和试验期间，饲料投喂量为乌鳢体质量的3%，观察乌鳢的行为、症状和死亡率。采用文献[7]的评价指标，筛选攻毒后死亡率最高且存活时间较长的菌液浓度ρg，作为后续试验攻毒菌液浓度。

1.5.2 治疗试验

试验按治疗方式共设置6 组，分别标记为HNK高剂量组、HNK 中剂量组、HNK 低剂量组、阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，每组放养乌鳢20 尾，于1 m3水族箱中暂养1 周后开始治疗试验。6 组乌鳢均经腹腔注射0.5 mL 浓度为ρg的诺卡氏菌液，攻毒6 h 后，开始治疗。其中用HNK 治疗的3 组，HNK 剂量分别为2.0，0.7 和0.2 g/kg，给药方式均为拌料给药，连续给药4 d。阳性对照组采用氨苄西林[10]治疗，给药剂量为0.25 mg/kg，给药方式均为拌料给药，连续给药7 d。阴性对照组攻毒不给药，空白对照组不攻毒、不给药。6 组乌鳢均每天投喂1 次，投喂量均为其体质量的3%。给药后饲养14 d，记录鱼行为、症状变化以及死亡量。采用症状减幅，描述用药后某症状减少幅度，计算公式如下。

2 结果与分析

2.1 体外抑菌试验

2.2 乌鳢感染诺卡氏菌后的症状

攻毒后，乌鳢出现游泳迟缓、食欲下降现象，部分鱼出现吞食后吐出。病鱼体出现散点状出血，肛门、鱼鳍根部发红，鳃部充血。解剖观察，病鱼肾脏肿大或呈不规则隆起，肝脏、肾脏有乳白色结节。乌鳢感染诺卡氏菌后症状见图1（a）（b）（c）。各攻毒组出现典型症状尾数见表3。

图1 乌鳢感染诺卡氏菌后症状

表3 各攻毒组出现典型症状尾数

2.3 不同剂量诺卡氏菌对乌鳢死亡率影响

不同攻毒剂量对乌鳢死亡率的影响见图2。由图2 可见，对照组（注射生理盐水组）共计死亡1 尾，死亡率5%。各攻毒组在1~6 d 未出现死亡，从7 d 开始死亡率逐步上升，各感染组（2×105，2×106，2×107，2×108和2×109cfu/mL）14 d 累计死亡率分别为10%，25%，80%，100%和100%，攻毒组死亡率高于对照组（0 cfu/mL）。

图2 不同攻毒剂量对乌鳢死亡率的影响

此外，乌鳢死亡率与攻毒菌液浓度成正相关。2×108和2×109cfu/mL 感染组14 d 内死亡率均为100%，但2×109cfu/mL 感染组在第12 d 全部死亡，而2×108cfu/mL 感染组在第14 d 全部死亡。

2.4 HNK 对乌鳢诺卡氏菌病治疗效果

图3 不同剂量HNK 对乌鳢诺卡氏菌病治疗效果

表4 攻毒试验各治疗组出现典型诺卡氏菌病症状鱼数量 尾

表5 用药组典型症状减幅 %

3 讨论

3.1 乌鳢感染诺卡氏菌的症状及死亡率

文献[8，15]攻毒试验中，1~6 d 各组均未发现死亡病例，这可能是因为诺卡氏菌生长慢，病程长，感染后不会立刻出现死亡，此结果与本攻毒试验结果一致。

3.2 HNK 对诺卡氏菌的抑制效果

本治疗试验中，HNK 高、中剂量组死亡率相比阴性对照组有明显下降，且优于阳性对照组（抗生素组）。可见HNK 能够有效提高诺卡氏菌感染后病鱼的存活率。症状减幅结果显示，HNK 高、中剂量组结果相近，但均明显优于阳性对照组与HNK 低剂量组。HNK 高、中剂量组内脏结节与体表溃疡症状减幅较肾脏肿大，这可能是因为肾脏肿大是诺卡氏菌病早期症状，注射攻毒后，在较短时间内产生，HNK 用药后，用药后能够抑杀病原菌，阻断其在体内扩散，感染后期的体表溃疡及内脏结节等病重症状减少。

综合HNK 体外抑菌效果以及治疗试验，认为HNK 高、中剂量给药，能够有效防控诺卡氏菌感染引起的相关疾病，且效果优于受试抗生素（氨苄西林）。

3.3 诺卡氏菌感染途径与防控方案

本试验中，攻毒试验采用腹腔注射进行人工感染，对比口服、浸泡、创伤浸泡发现，其感染率明显低于腹腔注射，口服和浸泡感染基本无效[7]。文献[15，17]的研究结果也类似。因此认为，在实际养殖环境中，诺卡氏菌经口腔感染的可能性较低。此外，本攻毒试验中，乌鳢感染诺卡氏菌后，其体表溃疡出现频率低，溃疡部位面积小，未发现养殖中常见的鳃部、皮下结节症状。由此可见，感染途径不同，出现症状亦不同。在养殖中，诺卡氏菌最可能的感染途径是经体表创伤处感染。因此，建议养殖业者在养殖对象出现应激反应、鱼体擦伤或因寄生虫啃噬产生伤口后，应及时进行细菌病害预防，避免感染和扩散。