鱼类神经行为毒性研究进展

王旭，闫有利

（辽宁省淡水水产科学研究院，辽宁省水生动物病害防治重点实验室，辽宁 辽阳 111000）

神经行为毒性，是有害因素对动物神经系统和神经行为产生的损害和影响，它反映外界因素对生物个体整体水平健康危害程度，是一种非死亡的有害效应[1]。近年来，水环境污染问题日趋严重，环境中各种污染物在水体中积累，水环境已成为各类无机污染物[2]和有机污染物[3]的主要污染场所，水环境污染和水质安全，受到人们广泛关注。鱼类是水生态系统中最重要的物种之一，其组织和器官发育机制高度保守[4]，与哺乳动物同源[5]。鱼类的游泳行为模式与哺乳动物（包括啮齿动物和人类）行为模式相似[6]，如其个体行为中的速度、高度、转弯次数等，群体行为中的平均距离、分散度、分形维数等。鱼类对水环境中污染物的变化也很敏感，其神经系统能够对各种刺激产生综合协调的应答反应，其游泳速度、游动距离、游动时间和绝对转角等游泳行为，因环境发生异常而改变，即感觉和运动的神经反射及信息整合等行为表现，包括社交、焦虑、学习和记忆以及防御能力等社会行为[7]，具有复杂性、规律性、特定性、高度可变性以及适应性强等特点[8]。已有研究表明[9]，在极低浓度的污染物暴露中，多种污染物可在鱼体内富集，诱发鱼类感觉效应、运动效应、认知效应以及情感和个性心理效应等，改变鱼类的游泳行为（游泳速度、游泳距离、绝对转角和活动时间）和社交行为，致使鱼类出现神经行为异常，产生神经行为毒性。鱼类的游泳行为可作为神经毒性效应的敏感终点指标。同时众多的试验鱼品系具有遗传背景均一、试验重复性好、可比性强等优点，是研究神经行为毒性的重要试验动物。鱼类的全基因组学研究，阐明其生物学特征和基因组结构之间的内在联系，为神经行为毒性研究提供了重要的分子基础。现从鱼类生物学特征、试验鱼类、全基因组测序和鱼类种内变异（品系、年龄、性别、个体差异和社会地位）4 个方面，简述鱼类神经行为毒性研究进展，展望今后鱼类神经行为毒性的研究方向，以期为神经行为毒性基础研究和应用提供参考依据。

1 鱼类生物学特征

鱼类生物学特征，是开展神经行为毒性研究的重要基础。与哺乳动物相同，大部分鱼类雌雄异体，表现出两性异形[4]。在生理结构和功能上，鱼类组织和器官与哺乳动物同源，其发育过程和调控机制与哺乳动物高度保守[4]，如鱼类中枢神经系统具有与哺乳动物的同源结构，特别是关键脑区功能相同[5]。斑马鱼端脑区背侧（Dm）的内侧区和腹侧端脑区（Vd）的背核，与哺乳动物杏仁核和纹状体同源，为探索情绪记忆和动机行为提供材料，进一步支持了鱼类作为研究行为神经机制的模式生物。鱼类神经元的形成及分化等过程与其他脊椎动物相似且高度保守[10]，其中枢神经系统发达[11]，具有基本脊椎动物大脑结构和组织以及神经化学信号通路[5]，如斑马鱼神经递质系统在进化上更加保守，更适于开展焦虑相关障碍研究[12]。

鱼类神经系统，能够对各种刺激产生综合协调的应答反应[7-8]。如斑马鱼胚胎，在27 hpf（hour post-fertilization, hpf）可以运动（肌肉效应初期），48~72 hpf 开始游泳[13]，在4 dpf 开始自由游泳生活[14]，具有昼夜活动节律[15]，其运动行为变化随早期发育的过程有序产生，其行为复杂，特征鲜明，易于采用行为学试验手段，对视觉、嗅觉和听觉功能进行检测（趋光试验、惊恐反射试验以及嗅觉偏好等）[8]。目前，已确定斑马鱼在胚胎期、幼鱼期和成鱼期存在100 多种行为[16]。研究者可从多角度研究斑马鱼群体的社会行为：（1）观察群体中自由游泳的受试鱼个体，记录行为参数，如个体间距离及个体的同步运动[17]；（2）进行社会偏好测试，包括使用社会刺激来研究个体对群体的行为反应[17]。

基于鱼类神经系统及其表现出的行为特征，神经毒理学研究表明，斑马鱼暴露在药物以及污染物中，表现出生物累积和一些毒性效应，如分子、生化、形态、生理和行为等变化[18]，其行为学指标与刺激物相关联，与哺乳动物（包括啮齿动物和人类）相似[6]，证明鱼类是研究神经行为学和毒理学等神经毒性表观效应的有效工具和优良物种。

2 试验鱼类

试验动物具有遗传背景均一、试验重复性好、可比性强等特点，被国际学术界公认为“活的精密仪器”，是医学、生命科学研究的基础和重要支撑条件。神经行为毒性研究表明，微塑料[9]、重金属[9]、有机污染物[19]等污染物暴露，改变斑马鱼（Danio rerio）、青鳉（Oryzias melastigma）、金鱼（carassius auratus）等试验鱼类的游泳行为和社交行为，表明试验鱼类是研究神经行为毒性的重要材料。目前培育出试验鱼类有斑马鱼近交系（Danio rerio）[20]、剑尾鱼（Xiphophorus couchianus）[21]、青鳉[22]、虹鳉（Poecilia reticulata）[23]、金鱼[24]、虹鳟（Salmo gairdneri）[25]等。育成20 代以上的近交系有斑马鱼近交系（Danio rerio IM[20]）、剑尾鱼近交系（Xiphophorus couchianus[21]、X.helleri Cd[21]、X.helleri strigatus[26]、X.helleri guentheri[26]、X.helleri helleri[26]、X.helleri RRB[26]、X.maculatus Jp 163 A[21]、X.maculatus Jp 163 B[21]、X.montezumae cortezi[26]和X.xiphidium[26]）、青鳉近交系（O.latipes HBI-I[27]、O.latipes HNI-II[27]、O.latipes HO4C[28]、O.latipes HO5[28]、O.latipes HdrR[27]、O.latipes HB32D[28]、O.latipes HB11A[28]、O.latipes Hsok[27]和O.latipes Hi3[28]）和花鳉近交系（Poeciliopsis lucida[29]、P.monacha S68-4[29]和P.monacha S68-5[29]）等。众多品系的试验鱼，为神经行为毒性研究提供重要的试验动物，保证研究结果的科学性、准确性、重复性和可靠性。

3 鱼类全基因组测序

鱼类基因组解析，在鱼类遗传学、发育生物学、免疫学、生殖生物学、内分泌学等基础研究方面，具有重要意义和应用价值，是研究鱼类神经行为毒性的分子机制基础。通过参考基因组比较表明，71.4%人类基因与斑马鱼基因同源，47%的人类直系同源基因，与斑马鱼同源基因是一一对应关系，82%人类致病基因、发育信号传导通路与斑马鱼基本近似[30]。目前，国外研究者已经完成红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）、绿河豚（Tetraodon nigroviridis）、青鳉（Oryzias latipes）等29 个鱼类物种的全基因组测序[31]。我国已完成半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、弹涂鱼（Scartelaos histophorus, Boleophthalmus pectinirostris, Periophthalmodon schlosseri, Periophthalmus magnuspinnatus）、鲤（Cyprinus carpio）等22 种鱼类的全基因组测序和绘制精细图谱[32]。在“2019 年国际海洋基因组会议（ICG-Ocean 2019）”上发布的万种鱼基因组计划（Fish 10000 Genomes Project，简称Fish10K），已完成105 种基因组测序。另外，还有石斑鱼、鲢和黄姑鱼（Nibea albiflora）等数十种鱼类的全基因组测序和基因组资源发掘工作，正在开发中[32]。聚焦鱼类基因组研究，建立高质量的鱼类基因组数据库，获取有关物种的基因组序列信息，为鱼类的种质鉴定、遗传育种、动物营养、环境毒理和病害防治等领域，提供分子基础，进而阐明鱼类生物学特征和基因组结构之间的内在联系，为神经行为毒性研究提供重要的分子基础。

4 鱼类种内变异

种内变异，是指同种生物不同个体间的表型或遗传差异，如品系、年龄、性别和个体等生物学性状差异[33]，不同的表型个体间表现出高度的行为差异。

4.1 品系

鱼类物种资源丰富，品种繁多。目前，研究人员已开发出3 000 多个斑马鱼品系和200 多个转基因品系（野生型品系除外）。不同品系斑马鱼基因型不同，其行为特征具有品系差异，如豹纹品系斑马鱼，进入水体上层的潜伏期长于白化突变品系和野生型斑马鱼，豹纹品系和白化突变品系，在水体上层停留时间均少于野生型斑马鱼[34]。Benner 等[35]研究发现，硒影响不同品系斑马鱼（Nadia、Gaighatta、Scientific Hatcheries 和TM1）行为（水平和垂直游泳位置），这与相关基因sepp1a、secp43 和dio2 在大脑中呈差异性表达相关。在应激和焦虑行为方面，不同斑马鱼品系表现出焦虑遗传差异，如豹纹品系和白化突变系为高焦虑品系，而野生型品系则表现出低焦虑行为[34]，这为量化和确定斑马鱼品系行为特征提供了基础数据。Millot 等[36]利用虹鳟（Oncorhynchus mykiss）等基因系，评估鱼类个性特征的遗传变异性，证明不同品系对环境刺激敏感程度不同。对大口马苏大麻哈鱼（Oncorhynchus masou macrostomus）品系行为模式研究证明，对于不同实验室环境的反应，其行为特征并不完全相同（20 个基本行为特征中有17 个不同）[37]。

4.2 年龄

年龄是神经行为学研究中重要的生物学变量。在早期发育过程中，斑马鱼运动行为变化随早期发育的过程有序产生，其行为复杂，特征鲜明。如斑马鱼胚胎在咽囊期（24~48 hpf）出现明显的行为发育，胚胎出现有节律地泳动，出现蠕动，且随胚胎发育，胚胎泳动加快，节律性增强。如在原基-5 期（24 hpf），胚胎发生自发的躯干和尾部的侧向收缩；在原基-15 期（30 hpf），胚胎收缩速率降低，出现蠕动；在高胸鳍期（42 hpf），仔鱼静息时侧躺，卵黄囊向上倾斜，触碰时会引起强烈而快速反应，其蠕动节律慢[38]；孵出仔鱼（48~72 hpf）通常以侧身或以背上位静息，可以自由游泳[13]。早幼期幼体开始活跃游动，其行为特征可采用游泳速度、游动距离、绝对转角、活动时间和逃逸行为等指标进行监测[14]，具有昼夜活动节律[15]；幼体对外界刺激，表现出复杂行为，包括社交、焦虑、学习和记忆以及防御能力等社会行为[39]。随年龄的增长，斑马鱼的运动能力也随之发生相应的变化。Philpott 等[40]研究表明，10 月龄斑马鱼，运动能力强于32 月龄斑马鱼，证明随着年龄的增长，斑马鱼运动能力呈逐渐下降趋势。Glazer 等[41]证明，BDE-47（2，2’，4，4’-四溴联苯醚）（0.1 μmol/L）对不同年龄斑马鱼神经行为毒性不同，幼鱼（144 hpf）的运动活性降低，成鱼（6 月龄）焦虑相关行为有所减少。

4.3 性别

性别是影响斑马鱼类行为特征的生物学变量。雌性和雄性斑马鱼的运动能力和社会行为并不相同，如10 月龄和22 月龄雄鱼的游动能力明显高于同龄雌鱼[40]。在社会行为方面，雄性斑马鱼（TM1、SH、Nadia 和LWT）通常比雌性斑马鱼表现出更勇敢的社交行为[42]和探索行为[43]，并在慢性压力下，表现出更强的攻击性及相应的皮质醇水平[44]。在同一品系中，不同性别斑马鱼的集群行为不同，金色品系和豹纹品系雌鱼，更喜欢与同一品系其他个体集群[45]。多变量数据分析表明，群体中雄性比雌性更勇敢[43]。

斑马鱼对药物反应存在性别依赖性。对可卡因戒断研究发现，雌鱼焦虑样行为出现较早，而雄鱼的焦虑样行为则更强烈、更持久[46]。Nielsen等[47]研究证明，艾司西酞普兰（Escitalopram）影响斑马鱼的行为反应，且存在明显的性别差异。如暴露于艾司西酞普兰（1.50 μg/L）中，雌鱼最快游泳速度减慢，停留次数减少，并表现出更勇敢的行为；而雄鱼则出现最快游泳速度减慢的现象。艾司西酞普兰对雄鱼和雌鱼的摄食行为有影响，艾司西酞普兰（0.10～1.50 μg/L）显著减少雄鱼摄食时间（减少27%）和最长摄食持续时间（减少42%），总摄食时间显著缩短73%，而雌鱼仅表现为最长摄食时间显著缩短41%[47]，可见，艾司西酞普兰对雄性斑马鱼的摄食行为影响更为显著。Singer 等[48]研究证明，氟西汀（fluoxetine）和尼古丁（nicotine）影响不同性别斑马鱼的游泳速度，如氟西汀（10 mg/L）和尼古丁（1 mg/L）暴露雄鱼的游泳速度略快于雌鱼，但雌鱼的游泳速度更稳定。

4.4 个体差异

为了更好地理解种群中鱼类个体差异，Araujo-Silva 等[49]评估酒精对不同类型斑马鱼行为特征的影响，结果表明，勇敢型斑马鱼，在无乙醇暴露时，游泳速度更快，而胆怯型斑马鱼在无乙醇和0.10%乙醇暴露时，出现比最快游泳速度更快的现象。证明乙醇影响不同类型斑马鱼行为特征，勇敢型斑马鱼对这些变化更具抵抗力。不同类型斑马鱼，在乙醇作用下，表现出的集群（社会）行为也不相同。勇敢型个体的集群效应随乙醇浓度增加而增强；与勇敢型斑马鱼表现不同，胆怯型个体，则在无乙醇暴露时，表现出明显的集群效应，而在0.1%～0.5%乙醇暴露时，其集群效应明显减弱[50]。鱼类行为差异，可能与其体内基因表达以及代谢物的水平相关。Lguchi[37]评估大口马苏大麻哈鱼2 个家系中个体行为特征，结果表明，鱼类个性行为可能具有遗传基础。Filby 等[51]研究证明，与攻击行为相关的基因，如雌激素受体（esr1、esr2a 和esr2b）和色氨酸代谢（tph1a、tph1b 和tph2）基因，在大脑表达因性别而异，表明斑马鱼个性行为可能与基因表达有关[52]。Dahlbom 等[53]研究表明，斑马鱼的行为差异，可能与其体内神经递质（多巴胺、5-羟色胺及其代谢物等）水平相关，雌性个体前脑中的5-羟色胺及其代谢物水平较低，但多巴胺水平较高。

4.5 社会地位

在群居性鱼类中，不同个体在群体中社会地位不同，其血浆皮质醇浓度[54]、代谢率[55]、增长率[56]、肝脏能量储备[55]、抗病性[57]、鳃的钠吸收率[58]以及铜和银的吸收率[59]均不相同，可能导致其对重金属敏感度和神经行为毒性不同。Sloman 等[59]通过研究群体中不同社会地位虹鳟（Oncorhynchus mykiss）对铜和银的吸收强度，验证群体中处于不同社会地位个体对重金属吸收率不同。Henry 等[60]研究铜对蓝鳃太阳鱼（Lepomis macrochirus）群体社会行为的影响，表明在铜（≥0.034 mg/L）暴露期间，太阳鱼社会群体行为发生显著变化，如处于劣势地位的个体，出现咳嗽、打哈欠和甩鳍的频率高于种群中其他个体，而处于优势地位的太阳鱼次之，但其攻击性增强，表明太阳鱼个体在社会群体中地位与其重金属敏感度和神经行为毒性相关。

5 展望

5.1 注重受试试验鱼类的多样性

在目前神经行为毒性研究中，受试试验鱼类多为单一物种（斑马鱼），而研究物种单一化，导致研究人员不能科学、系统地确定污染物的神经行为毒理学效应。应选取2 种或2 种以上具有代表性的试验鱼类（如淡水鱼类和海水鱼类），开展神经行为毒性研究，科学、准确地确定污染物对鱼类的神经行为毒性。

5.2 建立鱼类神经行为毒性数据库

结合目前鱼类神经行为毒性研究，建议以试验鱼类为研究材料，利用计算机图像跟踪处理技术，采用图像解析法，系统地开展鱼类神经行为毒性研究，明确鱼类游泳行为参数，确定鱼类游泳行为模式，制定鱼类神经行为毒性标准，建立鱼类神经行为毒性数据库，为水生态风险评估提供基础数据。

5.3 解析鱼类神经行为毒性分子机制

在生命科学领域，多组学（基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等）技术和方法日趋完善，鱼类神经行为毒性研究应结合鱼类神经行为模式，利用组学研究思路和手段，在分子水平、转录水平、蛋白质水平和代谢物水平方面，开展鱼类神经行为毒性研究工作，进行多组学关联分析，揭示鱼类神经行为毒性的致毒机制。

6 结语

鱼类是水生态系统中重要的物种之一，生理结构与哺乳动物同源，具有高度发达的神经系统，其行为具有复杂性、规律性、特定性、高度可变性以及适应性强等特点。鱼类对水环境中污染物的变化最为敏感，能够对各种刺激产生综合协调的应答反应，改变行为模式，表现为神经行为毒性。鱼类的游泳行为可作为神经毒性效应的敏感终点指标。鱼类生物学特征是开展神经行为毒性研究的重要基础。众多品系的试验鱼为神经行为毒性研究提供了重要的试验动物。鱼类基因组序列信息，为鱼类行为学提供分子基础。鱼类种内变异，为研究同一物种不同的表型个体间表现出高度的神经行为毒性差异，提供重要的试验材料。鱼类是研究神经行为毒性的重要物种。