苦杏仁苷减少冠状动脉内皮细胞焦亡并改善载脂蛋白E 缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块形成

刘瑾 张洁 冯莹

武汉市第一医院心血管内科（武汉 430000）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是多种心脑血管疾病的主要病理基础，在血管壁中可以观察到细胞死亡的数量增加［1］。细胞焦亡是一种新发现的程序性细胞死亡，与多种心血管疾病有关，包括AS［2-4］。已知生物草药提取物通常具有多种成分，可诱导多种生物活性。苦杏仁苷（amygdalin，AMY）具有抗炎抗肿瘤和抗AS 等的生物学和药理学活性［5］。有研究［6］发现，AMY 可减轻AS 并在载脂蛋白E（ApoE）敲除小鼠和骨髓来源的巨噬细胞中发挥抗炎作用。此外，既往研究［7］发现以AMY 为主要成分的补阳还五汤甙对大鼠脑缺血再灌注损伤后的细胞焦亡具有神经保护作用。然而，AMY 是否参与AS 诱导细胞焦亡及其发生机制尚不明确。因此，本研究构建了AS 小鼠模型以及ox-LDL 诱导的人冠状动脉内皮细胞（HCAECs），探讨AMY 是否有效缓解AS 进展以及可能机制，为临床治疗AS 提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 10 ～12 周龄载脂蛋白E 缺陷（ApoE-/-）雄性小鼠40 只，购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，许可证号SCXK（鄂）2021-0011。本实验经武汉市第一医院实验动物伦理委员会批准进行。

AMY（长沙Staherb天然成分有限公司）；HCAECs（美国ATCC 细胞库）；ox-LDL（美国Sigma 公司）。OTC 冰冻切片包埋剂（上海睿铂赛生物科技有限公司）；DMEM 培养液、胎牛血清（美国Hyclone 公司）；青霉素-链霉素、0.25%胰蛋白酶/EDTA 消化液（美国Sigma 公司）；引物合成由上海生工生物合成；转染试剂Lipofectamine®3000（美国Sigma公司）；蛋白裂解液（北京Solarbio 科技有限公司，货号：R0010）；Caspase-1（ab207802）、GSDMD（ab209845）、Gal-3（ab209344）、JMJD3（ab169197）和β-actin（ab8227）一抗及相应二抗（英国Abcam公司）；RT-qPCR 试剂盒（Vazyme 生物科技有限公司，货号：Q511-02）；CCK-8 试剂盒（美国MCE 公司，货号：HY-K0301）；总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒（武汉Elabscience Biotechnology 试剂公司）；高通量实时荧光定量聚合酶链锁反应（PCR）仪（Roche 公司，瑞士）；Western blot 系统（北京六一仪器厂DYY-7C）；台式低温高速离心机（日本KUBOTA 公司）；细胞培养箱（上海力申科学仪器公司）；凝胶成像分析仪（广州瑞丰实验设备有限公司）；倒置显微镜（日本Olympus）。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠AS 模型构建及分组 将所有ApoE-/-小鼠维持在受控环境中，光照/黑暗循环为12 h，温度为（20 ± 2）℃，湿度为（50 ± 2）%。适应环境1 周后，将小鼠分为4 组：对照组（Control）、模型组（Model）、2.5 mg/kg AMY 组、5 mg/kg AMY 组。其中Model、2.5 mg/kg AMY 和5 mg/kg AMY 组小鼠喂食由21%脂肪、19.5%酪蛋白和1.25%胆固醇组成的高脂饮食（HFD）12 周以加速动脉粥样硬化的发展，Control 组喂食正常饲料。将水溶性白色粉末形式的AMY溶于0.9%盐水中，使用直径为0.22 μm 的特定脱气过滤器过滤AMY 溶液。HFD 喂养12 周后，2.5 mg/kg AMY 和5 mg/kg AMY 组小鼠腹膜内注射2.5、5 mg/kg AMY，Model 组注射相同体积的0.9%盐水，每天1 次连续4 周。小鼠在二氧化碳窒息处死前12 h 禁食。

1.2.2 小鼠基本生化指标的测定 小鼠禁食过夜后收集血液样品。在4 ℃以1 000 ×g离心10 min立即分离血浆，取上清分装。酶比色法测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量。

1.2.3 动脉粥样硬化病变的油红O染色分析 将小鼠动脉冷冻切片用油红O 溶液（0.5%异丙醇溶液，用3∶2 比例的双蒸水稀释）在室温下染色1 h，并用Image J 软件定量测定主动脉根部脂质沉积和斑块形成。

1.2.4 细胞培养及分组 将HCAECs置于含10%胎牛血清和1%青链霉素（100 U/mL 青霉素、100 U/mL链霉素）的DMEM 培养基于37 ℃、5% CO2恒温箱中培养，每2～3 天更换1 次培养基。当细胞汇合至80%时，用胰蛋白酶消化重悬后按照3∶1 的比例进行传代培养，每24 小时更换1 次培养基。空白对照组（Control）：细胞不做任何处理；ox-LDL：细胞使用20 μg/mL ox-LDL 处理24 h（其中ox-LDL 制备如下：将人低密度脂蛋白在含有10 μmol/L Cu2SO4的磷酸盐缓冲盐水中氧化，并加入过量的乙二胺四乙酸以停止氧化。ox-LDL 的纯度高于97%，浓度为1.0 ～3.9 mg/mL）；50、100 μg/mL AMY：细胞用20 μg/mL ox-LDL 刺激24 h 后添加50、100 μg/mL AMY 处理继续培养24 h；ox-LDL+AMY+pcDNA-3.1/pcDNA-Gal-3 组：细胞用20 μg/mL ox-LDL 刺激24 h 后转染pcDNA-3.1/ pcDNA-Gal-3 载体，24 h 后添加100 μg/mL AMY。继续培养48 h，裂解细胞收集蛋白。

1.2.5 细胞转染 利用Lipofectamine®3000 分别将pcDNA-3.1 和pcDNA-Gal-3 转染进HCAECs 中，以pcDNA-3.1 作为对照，具体步骤参照转染试剂Lipofectamine®3000 制造商说明。

1.2.6 荧光定量-PCR（RT-qPCR）检测IL-1β 和IL-18表达水平 使用TRIZOL 试剂盒提取总RNA，合成cDNA 模板，用SYBR ExScript qPCR 试剂盒在以下条件下进行：95 ℃预变性2 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火25 s，在72 ℃延伸15 s，进行35 个循环。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。依据2-ΔΔCt法计算各mRNA 样本相对表达量。

1.2.7 Western blot检测蛋白表达 将各组HCAECs按照每孔1 × 105的密度接种于6 孔板。使用RIPA裂解液提取总蛋白，24 h 后采用BCA 法进行蛋白定量。随后各取30 μL样品进行SDS-PAGE，将蛋白转移至膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入Ⅰ抗，4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗37 ℃孵育45 min，用ECL 液显影，使用化学发光试剂盒在化学发光系统检测，随后结果采用Image-Pro Plus 6 软件（Media Cybernetics）分析，以待测蛋白与内参照β-actin 的灰度值比值作为蛋白的相对表达量。

1.2.8 细胞存活率检测 将HCAECs（1 × 105细胞/孔）接种到96 孔板中，并与不同浓度的AMY 孵育24 h。将细胞加入CCK-8 溶液（10 μL/孔）并培养1 h。然后在450 nm 下测量每个孔的吸光度以确定细胞存活率。

1.2.9 TUNEL 检测细胞焦亡 根据制造商的方案使用TUNEL 测定试剂盒评估细胞死亡，将细胞用DAPI 染色用于核复染，并在倒置显微镜下观察。从每个样本的两个部分随机选择图像。

1.2.10 染色质免疫沉淀检测 将HCAECs（4 ×106个细胞/孔）接种到10 cm 培养皿中培养24 h，然后使细胞进行标准交联。将细胞在裂解物中裂解，用JMJD3 和H3K27me3 抗体进行免疫沉淀。用RNA 酶A 和蛋白酶K 处理免疫沉淀的DNA，苯酚-氯仿提取然后乙醇沉淀纯化。通过实时PCR 分析纯化的DNA 和输入的基因组DNA。根据制造商的方案，用标准方法计算倍数富集。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 进行统计分析，呈正态分布的计量资料以（±s）表示。采用单因素方差分析、Dunnett-t法比较总体和总体中两样本均数之间的差异。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AMY 对HCAECs 存活率的影响 见图1A，与Control 组比较，200、400 和800 μg/mL AMY 干预HCAECs后细胞存活率明显降低（P＜0.01）。见图1B，与Control 组比较，ox-LDL 组HCAECs 存活率降低（P＜0.01），而50 和100 μg/mL AMY 相较于ox-LDL组细胞存活率升高（P＜0.01）。50 和100 μg/mL AMY 干预细胞36、48 h 时细胞存活率相较Control组明显降低（P＜0.01，图1C）。因此，本研究选择AMY 浓度为50 和100 μg/mL 做后续实验。

图1 不同浓度AMY 对HCAECs 存活率的影响Fig.1 Effect of different concentrations of AMY on the survival rate of HCAECs

2.2 AMY 对ox-LDL 诱导的HCAECs 细胞焦亡的影响 与Control组相比，ox-LDL 组Caspase-1（图2A和2B）和GSDMD（图2A 和2C）蛋白水平增加，IL-1β 和IL-18 mRNA 水平上调（图2E-2F），TUNEL 阳性细胞率升高（图3A 和3B），Gal-3 蛋白表达增加（图2A 和2D）（P＜0.01）。与ox-LDL 比较，50 和100 μg/mL AMY 组Caspase-1、GSDMD 和Gal-3 蛋白水平以及TUNEL 阳性细胞率呈剂量依赖性降低（P＜0.05）。

图2 AMY 干预对ox-LDL 诱导HCAECs 细胞焦亡的影响Fig.2 Effect of AMY intervention on ox-LDL induced pyroptosis in HCAECs

图3 AMY 干预HCAECs 后的TUNEL 染色Fig.3 TUNEL staining after AMY intervention in HCAECs

2.3 苦杏仁苷能够抑制JMJD3 介导的Gal-3 去甲基化 与IgG 相比，JMJD3 和H3K27me3 在Gal-3上的富集显著增加（P＜0.01）。与Control 组相比，AMY 组Gal-3 上的JMJD3 富集降低（P＜0.01），H3K27me3富集升高（P＜0.01），见图4A。与Control组相比，ox-LDL 组JMJD3 蛋白表达水平明显增加（P＜0.01）；而50 和100 μg/mL AMY 组HCAECs 细胞内JMJD3 蛋白表达相较于ox-LDL 组呈剂量依赖性降低（P＜0.05）。见图4C-F，与pcDNA-3.1 比较，pcDNA-JMJD3 组HCAECs 细胞内JMJD3 和Gal-3 mRNA水平以及Gal-3蛋白水平明显上调（P＜0.01）；与NC siRNA 相比，JMJD3 siRNA 组JMJD3、Gal-3 mRNA 和蛋白水平显著降低（P＜0.01）。见图4B。

图4 AMY 干预对JMJD3 介导Gal-3 表达的影响Fig.4 Effect of AMY intervention on JMJD3 mediated Gal-3 expression

2.4 Gal-3对AMY抑制ox-LDL诱导HCAECs细胞焦亡的影响 与ox-LDL+AMY+pcDNA-3.1 组比较，ox-LDL+AMY+pcDNA-Gal-3 组Gal-3（P＜0.01，图5A-B）、Caspase-1（P＜0.05，图5A 和5C）和GSDMD（P＜0.01，图5A 和5D）蛋白表达水平升高，IL-1β（P＜0.05，图5A 和5E）和IL-18（P＜0.01，图5A 和5F）mRNA 水平上调，TUNEL 阳性细胞率增加（P＜0.01，图6A-B）。见图5、6。

图5 Gal-3 对AMY 抑制HCAECs 细胞焦亡的影响Fig.5 Effect of Gal-3 on AMY inhibition of pyroptosis in HCAECs

图6 AMY 预处理HCAECs 后过表达Gal-3 的TUNEL 染色Fig.6 TUNEL staining of Gal-3 overexpression after AMY pretreatment of HCAECs

2.5 AMY 治疗后动脉粥样硬化小鼠中主动脉窦的病理分析及生化指标检测 与Model 组相比，2.5 mg/kg AMY 和5 mg/kg AMY 组小鼠中主动脉中脂质沉积减少（图7A），动脉粥样硬化病变面积百分比［2.5 mg/kg AMY 组病灶面积（8.64 ± 1.01），5 mg/kg AMY 组病灶面积（3.12 ± 0.84）］较Model 组（18.65 ± 1.16）组降低（图7B，P＜0.01）。与Control组相比，Model 组小鼠血清中TG、TC 和LDL 含量显著升高（P＜0.01），HDL 浓度降低（P＜0.01）。与Model 组比较2.5 mg/kg AMY 和5 mg/kg AMY 组小鼠血清中TG、TC 和LDL 浓度呈剂量依赖降低（P＜0.05），HDL 含量呈剂量依赖降低升高（P＜0.05）。见表1。

表1 小鼠血清生化指标检测Tab.1 Serum biochemical parameters of mice ±s，mg/dL

表1 小鼠血清生化指标检测Tab.1 Serum biochemical parameters of mice ±s，mg/dL

注：与control比较，**P ＜0.01；与Model比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别Control Model 2.5 mg/kg AMY 5 mg/kg AMY F值P值TG 25.1±8.5 191.4±18.9**115.2±16.3#68.3±5.4##27.98＜0.000 1 TC 142.3±18.4 683.8±38.5**411.6±42.0#256.3±35.1##45.65＜0.000 1 HDL 98.4±15.2 26.8±10.5**51.7±8.2#82.7±4.6##9.51＜0.000 1 LDL 16.3±8.5 192.5±21.3**93.0±24.5##57.3±18.4##15.49＜0.000 1

图7 AMY 治疗后小鼠主动脉油红O 染色Fig.7 Oil red O staining of mouse aorta after AMY treatment

2.6 AMY 治疗对小鼠主动脉焦亡标志物表达的影响 与Control 组相比，Model 组小鼠主动脉组织中Gal-3、JMJD3、Caspase-1和GSDMD 蛋白水平以及IL-1β 和IL-18 mRNA 表达均显著升高（P＜0.01）。与Model 组比较，2.5 mg/kg AMY 和5 mg/kg AMY 组小鼠主动脉组织中Gal-3、JMJD3、Caspase-1 和GSDMD 蛋白表达以及IL-1β 和IL-18 mRNA 表达水平呈剂量依赖降低（P＜0.05）。见图8。

图8 AMY 治疗后检测小鼠主动脉组织中焦亡标志物表达Fig.8 Detection of pyroptosis marker expression in mice aortic tissues after AMY treatment

3 讨论

在本研究中，首先发现模型组小鼠主动脉组织中细胞焦亡标志蛋白Caspase-1、IL-1β、IL-18 和GSDMD 表达水平与Control 组相比显著升高，动脉粥样硬化病变面积百分比增加，提示在AS 小鼠中细胞焦亡是一种主要的细胞死亡形式。在接下来的细胞模型中我们使用ox-LDL 诱导HCAECs 发生焦亡，结果显示Caspase-1、IL-1β、IL-18 和GSDMD表达水平显著上调，TUNEL 阳性率增加，而50、100 μg/mL AMY 干预后HCAECs 内Caspase-1、GSDMD 和Gal-3 蛋白水平以及TUNEL 阳性细胞率较ox-LDL 组呈剂量依赖性降低。随后，在机制研究中发现AMY 干预能够抑制JMJD3 介导的Gal-3 启动子H3K27me3 去甲基化，而Gal-3 过表达后HCAECs内细胞焦亡标志蛋白的表达水平显著上调，TUNEL阳性细胞率明显增加。

AS 是一种多因素慢性炎症性动脉疾病，是冠心病、心力衰竭、中风等多种心血管疾病的病理基础［8］。在人AS 病变中可以观察到细胞死亡的数量增加，特别是在晚期斑块中。通常，细胞死亡主要归因于细胞凋亡和坏死。然而，还发现了其他几种细胞死亡形式，包括细胞焦亡［9］。细胞焦亡是由炎性体介导的炎性细胞死亡的独特形式，并且依赖于Caspase-1 活化，可将细胞因子IL-1β 加工成活性形式，进而诱发细胞死亡［10］。GSDMD 是一种中枢效应和执行蛋白，通过诱导质膜孔的形成发生细胞焦亡［11］。有研究［12］发现，红景天苷可以减轻ApoE-/-中动脉粥样硬化诱发的细胞焦亡，其机制可能与抑制Caspase-1、IL-1β 和GSDMD 蛋白表达水平的下调有关。据报道［13］，细胞焦亡参与ox-LDL 诱导的HCAECs 死亡，这进一步证实了本研究结果。

天然药物成分具有强大的治疗潜力，原因主要归于其安全性、有效性、较少的副作用以及经济效率［14］。AMY 是一种天然的氰苷，存在于一些可食用植物的种子中，如苦杏仁和桃子。迄今为止，AMY 已被广泛用于治疗哮喘、支气管炎、肺气肿、麻风病、糖尿病和癌症等［15-16］。已有研究［17］报道AMY 可能通过调节ApoE-/-小鼠中的调节性T 细胞（Tregs）来刺激免疫系统并表现出免疫调节功能。一项研究［6］发现，AMY 可以通过MAPKs、AP-1 和NF-κB/p65 信号通路在ApoE-/-小鼠和ox-LDL 处理的骨髓源性巨噬细胞中减轻动脉粥样硬化并发挥抗炎作用。本研究结果显示50、100 μg/mL 的AMY 干预对HCAECs 细胞活性无明显影响，而200、400、800 μg/mL AMY 干预HCAECs 后细胞存活率明显降低，说明果高浓度的AMY 对细胞具有毒性副作用。WANG 等［6］研究证实浓度为50、100 μg/ mL 的AMY 在50 h 内对骨髓来源的巨噬细胞没有带来任何显著的细胞毒性。此外，SHE等［7］研究发现补阳还五汤（主要包括黄芪甲苷、芍药苷和AMY）通过抑制脑缺血再灌注损伤后神经元的焦亡发挥神经保护作用，其潜在作用机制与NLRP3 对经典细胞焦亡途径的调节密切相关。然而，AMY 是否参与治疗AS 诱发的细胞焦亡发病机制仍需本研究的进一步探讨。

Gal-3 目前被认为是潜在的心血管炎症生物标志物［18］。它是一种29 ～35 kDa 高度保守的β-半乳糖苷结合凝集素，近几十年来在心血管疾病中受到广泛关注。Gal-3 已被确定为促炎分子，其功能是驱动炎症反应和氧化应激［19］。此外，Gal-3对AS 的进展有影响，包括内皮功能障碍，脂质内吞作用和血管平滑肌细胞迁移［20］。MACKINNON等［21］研究发现抑制Gal-3 可减少ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块形成。本研究发现，与Control 组相比，ox-LDL 组HCAECs 内Gal-3 蛋白表达显著增加；与ox-LDL 比较，50、100 μg/mL AMY 组HCAECs 内Gal-3 蛋白水平呈剂量依赖性降低。Jumonji 结构域3（JMJD3，KDM6B）是一种组蛋白去甲基化酶，能够特异性地去甲基化三甲基化H3 赖氨酸27（H3K27me3），是一种常规的抑制性组蛋白修饰［22］。Jmjd3 上调可以使启动子上抑制性H3K27me3 表观遗传标记去甲基化，最终导致靶基因表达增加［23］。一项研究［24］发现LPS 处理促进了JMJD3 表达，增强了Jmjd3 在人血管内皮细胞中的核积累，参与AS 发展。此外，JMJD3 能够使β-MHC 启动子处的H3K27me3 去甲基化，以促进其表达和心脏损伤，表明JMJD3 可能是心肌细胞中β-MHC 表达的关键表观遗传调节因子，也是心脏损伤的潜在治疗靶点27［25］，这与本研究结果类似。

综上所述，AMY 可有效改善ox-LDL 诱导的HCAECs 细胞焦亡以及HFD 饲养的ApoE-/-小鼠主动脉脂质沉积和斑块形成，其机制可能与调控JMJD3 介导的Gal-3 启动子H3K27me3 去甲基化有关。然而本研究仍存在一些局限性，首先，本研究动物实验仅设有2.5 和5 mg/kg 两个浓度梯度，尚未探索体内实验中AMY 对AS 小鼠治疗的最佳药物浓度。其次，研究机制不够全面，仍需进一步分析其他可能机制对实验结果的影响。此外，关于AMY 治疗ApoE-/-小鼠的AS 指标研究过少，对AS治疗的指导价值有限，下一步将着重开展体内动物实验及临床试验进一步验证AMY 对AS 的防治作用，旨在为AMY 参与AS 进展提供新的证据，并为AS 的治疗提供理论基础。

【Author contributions】LIU Jin designed this study and wrote the manuscript.ZHANG Jie performed the experimental work and provided the majority of statistical analysis as well as provided the figures and tables for the manuscript.FENG Ying collected a large amount of data for the dataset.All authors read and approved the final manuscript.