绞股蓝总苷对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝脏脂质代谢物的干预作用

李德周，奚瑛斐，辛鑫，李红山，3

1. 宁波市第二医院肝病科，浙江 宁波 315010

2. 上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所，上海 201203

3. 浙江省消化系统肿瘤诊治及研究重点实验室，浙江 宁波 315010

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是世界上常见的慢性肝病，全球患病率约为25%，我国患病率约为6%～38%[1-2]。其疾病谱广，包括单纯脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化，后者可进展为肝细胞癌。目前，NAFLD 的主要治疗措施为生活方式干预，尚缺乏安全有效的药物[3]。NAFLD 给社会带来了严重的医疗和经济负担，积极防治具有重要意义。绞股蓝总苷为中药草质攀援植物绞股蓝的主要成分，既往研究表明，绞股蓝总苷可通过调节脂质代谢治疗NAFLD[4-5]，但其具体作用机制尚未完全阐明。为进一步探讨绞股蓝总苷对NAFLD 脂代谢的调节机制，本研究拟采用高脂饮食诱导的小鼠NAFLD 模型，以奥贝胆酸为对照，应用液相色谱-质谱法（LC-MS）技术，探讨绞股蓝总苷对NAFLD脂质代谢的干预作用，研究结果将进一步揭示绞股蓝总苷治疗NAFLD 的作用机制，为研制作用机制清晰、效应物质明确的抗NAFLD 中药成分复方制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物饲养及分组给药C57BL/6 雄性小鼠32 只，16～20 g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物批号：SCXK（沪）2017-0003。动物饲养于上海中医药大学实验动物中心，温度24～26 ℃，湿度50%～60%，明暗各12 h，饲喂正常饲料，自由进食进水。自造模之日起，32 只小鼠随机分为正常组8 只，造模组24 只。正常组予正常对照饲料（10%脂肪，3.82 kcal/g）；造模组饲以高脂饲料（60%脂肪，5.21 kcal/g）喂养10 周。造模11 周将造模组小鼠随机分为模型组、绞股蓝总苷组、奥贝胆酸组，每组8 只。绞股蓝总苷组及奥贝胆酸组分别采用绞股蓝总苷［100 mg/（kg · d）］和奥贝胆酸［10 mg/（kg · d）］灌胃4 周，药物剂量和方法参考文献[5-6]，正常组和模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃4 周。

1.2 饲料与药物高脂饲料（货号D12492i）、正常对照饲料（货号D12450B）均购于美国Research Diets（New Brunswick）。绞股蓝总苷（中国上海荣合药业技术发展有限公司，批号171019）；奥贝胆酸（美国，BioVision，批号3J28B18980）。

1.3 试剂与仪器甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、葡萄糖测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠超敏胰岛素酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（美国，Crystal chem）。LC-MS（美国，赛默飞世尔科技，Q Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer）。

1.4 标本留取第14 周，禁食12 h，不禁水，称体质量，以3%戊巴比妥钠（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，下腔动脉取血5～10 mL，静置30 min 后离心（3000 r/min，15 min，离心半径13.5 cm），取上清液置于-80 ℃超低温保存。分离小鼠肝脏，在同一肝叶的相同位置切取2 小块组织，分别予10%福尔马林缓冲液固定及冷冻。

1.5 肝脏病理学检测根据已发表的标准方案，对4 μm 厚的切片进行苏木精-伊红染色法（HE）染色[7]。NAFLD 活动性标准（NAS）由有经验的肝脏病理学家测定。NAS 据以下评分确定：脂肪变性（0 分为＜5%；1 为5%～33%；2 为34%～66%；3 为＞66%）；小叶内炎症（0 分为无病变；1 分为＜2 个病变/视野；2 分为2～4 个病变/视野；3 分为＞4 个病变/视野）；气球变性（0 分为无；1 分为少见；2 分为多见）。

1.6 肝脏TG 含量测定取200 mg 湿肝，加入3 mL乙醇-丙酮（1∶1），匀浆（10000 r/min，20 s，2 次），静置过夜后离心（3000 r/min，20 min，4 ℃，离心半径13.5 cm），取上清液采用试剂盒检测。

1.7 生化指标测定血清TC、TG、AST、ALT、LDL-C、HDL-C、空腹血糖、空腹胰岛素采用试剂盒测定，均按说明书进行操作。胰岛素抵抗指数=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5。

1.8 肝脏脂质代谢物检测取50 mg 冷冻肝脏样本，加入800 μL 甲醇/水（1/1，v/v），匀浆；将匀浆液转移到玻璃进样瓶中，加入800 μL 氯仿，漩涡震荡30 s；冰水浴中超声提取10 min；4 ℃静置30 min后，离心（2000 r/min，15 min，离心半径13.5 cm，4 ℃）；取下层液体（氯仿层），转移至高回收率进样瓶，真空挥干；挥干后的脂质残渣用300 μL 异丙醇/甲醇（1/1，v/v）复溶（涡旋震荡30 s，超声3 min），离心（12000 r/min，15 min，离心半径16 cm，4 ℃），取200 μL 上清液用于LC-MS 分析。色谱条件：柱温为45 ℃，流速为0.4 mL/min，进样量为5 μL。流动相为：（A）乙腈-水（6∶4，v/v），含10 mmol/L 甲酸铵和0.1%甲酸；（B）乙腈-异丙醇溶液（1∶9，v/v），含10 mmol/L 甲酸铵和0.1%甲酸。线性梯度为：0～4 min，5%B；4～25 min，5%～95%B；25～35 min，95%B。质谱条件，电喷雾电离（ESI）正离子模式：加热器温度300 ℃；护套气体流量45 arb；辅气流量15 arb；尾气流量1 arb；喷雾电压3.0 kV；毛细管温度350 ℃；S-Lens 射频电平50%；扫描范围135～2000 m/z。ESI 负离子模式：加热器温度300 ℃，护套气体流量45 arb；辅气流量15 arb；尾气流量1 arb；喷雾电压2.5 kV；毛细管温度350 ℃；S-Lens射频电平60%；扫描范围：135～2000 m/z。获得的原始数据采用Progenesis QI 软件（美国，沃特斯公司）进行预处理。将标准化数据导入SIMCA 14.1 软件（瑞典，Umetrics）进行多元分析，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。根据OPLS-DA 的变量权重值（VIP）和P值（t检验），确定各组之间的差异脂质（VIP＞1 并且P＜0.05）。

1.9 统计学方法使用SPSS26.0 软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示。服从正态分布与方差齐性的2组比较采用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。脂质数据运用SIMCA 14.1 软件进行多元分析，包括PCA、PLS-DA、OPLS-DA 分析，以VIP＞1 并且P＜0.05 确定各组的差异脂质。

2 结果

2.1 各组小鼠HE 染色、NAS 积分、肝组织TG 含量改变见图1。正常组小鼠肝细胞形态正常，未见脂肪变性；模型组小鼠肝细胞体积增大，呈弥漫性脂肪变性，伴炎细胞浸润和气球样变；绞股蓝总苷组及奥贝胆酸组肝细胞上述表现减轻。此外，检测了各组NAS 积分、肝组织TG 含量。与正常组比较，模型组NAS 积分、肝组织TG 含量均升高（P＜0.05）；与模型组比较，绞股蓝总苷组与奥贝胆酸组NAS 积分、肝组织TG 含量均降低（P＜0.05）。

图1 各组小鼠HE 染色、NAS 积分、肝组织TG 含量改变

2.2 各组小鼠生化指标改变见图2。与正常组比较，模型组血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C、空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数均上升（P＜0.05）；与模型组比较，血清AST、ALT、TC、空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数在绞股蓝总苷组与奥贝胆酸组均下降（P＜0.05）；血清TG 在绞股蓝总苷组下降（P＜0.05），在奥贝胆酸组无明显差异；血清LDL-C 在奥贝胆酸组下降（P＜0.05），在绞股蓝总苷组无明显差异。血清HDL-C 在各组间差异无统计学意义。

图2 各组小鼠生化指标改变

2.3 绞股蓝总苷对NAFLD 小鼠肝脏脂质代谢物的影响

2.3.1 多元统计分析一般认为PCA 模型R2X＞0.5说明该模型效果较好，根据PCA 结果（见表1、图3a～c），3 个PCA 模型R2X 均大于0.5，提示该模型解释能力尚可。PCA 是一种无监督的降维分析法，需进行有监督的PLS-DA、OPLS-DA 分析。R2 和Q2 越接近1，表明模型越稳定可靠，Q2＞0.5 表明模型预测能力较好。根据PLS-DA 结果（见表1、图3d～f），模型组VS 正常组及模型组VS 奥贝胆酸组PLS-DA 模型解释能力及预测能力较好，模型组VS绞股蓝总苷组PLS-DA 模型解释能力及预测能力一般。根据OPLS-DA 结果（见表1、图3 g～i），3 个OPLS-DA 模型解释能力与预测能力均较好。置换检验结果表明OPLS 模型未发生过度拟合，结果可靠（见图4）。

图3 各组PCA、PLS-DA、OPLS-DA 结果

图4 各组置换检验结果

2.3.2 肝脏脂质代谢物变化见图5。研究以OPLS-DA 模型的VIP＞1 联合t检验P＜0.05 筛选差异脂质。模型组与正常组相比时，筛选出甘油酯类（GL）、甘油磷脂类（GP）、鞘脂类（SP）、脂肪酸类共67 种脂质，包括1 种鞘氨醇（So）、2 种鞘磷脂（SM）、6 种磷脂酰丝氨酸（PS）、1 种磷脂酰肌醇（PI）、1 种磷脂酰乙醇（PEt）、5 种磷脂酰乙醇胺（PE）、26 种磷脂酰胆碱（PC）、5 种磷脂酸（PA）、4 种溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、11 种溶血磷脂酰胆碱（LPC）、4 种单半乳糖二酰甘油（MGDG）和1 种脂肪酸（FA），其中39 种上调，28 种下调（见图5a）。绞股蓝总苷组与模型组对比时，筛选出GL、GP、SP、脂肪酸类共79 种脂质，包括1 种So，2 种SM，4 种PS，1 种磷脂酰甲醇（PMe），2 种PG，6 种PEt，13 种PE，21 种PC，3 种PA，4 种LPE，8 种LPC，6 种甘油二酯（DG），1 种TG，1 种代异鼠李糖甘油二酯（SQDG），4 种MGDG，2 种FA，其中60 种上调，19 种下调（见图5b）。奥贝胆酸组与模型组对比时，筛选出GL、GP、SP 类共55 种脂质，1 种So，5 种PS，1 种PEt，7 种PE，21 种PC，3 种PA，3 种LPE，7 种LPC，3 种DG，4 种MGDG，其中22 种脂质上调，33 种脂质下调（见图5c）。

图5 各比对组热图

2.3.3 各组共同差异脂质见表2。为了排除绞股蓝总苷组与模型组同向变化以及缺乏比对的脂质，本研究筛选了绞股蓝总苷组与模型组对比时以及模型组与正常组对比时的共同差异脂质。其中6 种脂质同向变化，17 种脂质反向变化。FA（18∶2）、LPC（16∶1）、MGDG（38∶5）、PA（24∶2/20∶4）、PC（36∶4，18∶1/18∶2）、PE（16∶0/18∶2）、PS（39∶2）水平在模型组中下降，在绞股蓝总苷组中升高；LPC（18∶1，20∶3，20∶4）、LPE（22∶6）、PA（26∶4/20∶4）、PC（38∶5，38∶3，16∶0/20∶3）、SM（d18∶1/18∶3）水平在模型组中上升，在绞股蓝总苷组中表达下降。同时，14 种脂质在奥贝胆酸组与模型组对比时也发生显著变化，其变化趋势与绞股蓝总苷组相同。

表2 各组共同差异脂质

3 讨论

NAFLD 是一种复杂的代谢性疾病，其发病机制尚不完全清楚，但肝脏脂质代谢异常已被证实与NAFLD 发生发展密切相关[8]。脂质组学是代谢组学的一个分支，被广泛应用于NAFLD 的药效学评价以及作用机制的研究。本研究应用LC-MS 技术进行脂质组学分析，发现NAFLD 小鼠经绞股蓝总苷干预后17 种脂质发生逆转，绞股蓝总苷主要影响NAFLD 小鼠脂肪酸类、GP、SP、GL 的代谢。

脂肪酸与NAFLD 发生发展密切相关，其摄取、转运、氧化、输出过程中任意一条途径受损均可引起或加重NAFLD[9]。同时，先前研究表明绞股蓝总苷治疗可提高NAFLD 小鼠肝组织小异二聚体伴侣（SHP）水平，下调靶基因固醇调节元件结合蛋白的表达，降低脂肪酸合成相关酶的水平，抑制肝脂合成。此外，绞股蓝总苷还上调了肝组织中过氧化物酶体增殖物激活受体α 和肉碱棕榈酰转移酶表达，增强脂肪酸氧化，促进脂质的分解[5]。本实验中，经绞股蓝总苷干预后，NAFLD 小鼠1 种FA 水平升高，这可能是绞股蓝总苷减少FA（18∶2）的氧化或者增加其合成。

GP 是生物细胞膜的重要组成部分，在NAFLD的进展中起着重要作用。PC 与PE 是哺乳动物细胞膜中最为丰富的磷脂[10]。在肝细胞中，高达30%的PC 由PE 经磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT）催化生成，同时PC 可通过PS 合成酶合成PS，PS 通过PS 脱羧酶合成PE[11]。在NAFLD 中，随着疾病进展，细胞内脂肪积累，诱导内质网应激，PE 水平下降[12]。本实验中，NAFLD 小鼠1 种PE 经绞股蓝总苷干预后水平升高。这可能由于绞股蓝总苷减轻NAFLD 脂肪变性，改善内质网应激，使PE 增加。此外，PC 是一种亲水性脂质，将TG（中性脂质）包装成极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL）从肝脏输出，PC 合成减少会影响VLDL 的合成与分泌，进而导致肝内脂质堆积[13]。经绞股蓝总苷干预后，NAFLD 小鼠2 种PC、1 种PS 水平升高，3 种PC 水平降低。在肝脏内，PC 与PE 的比例反映了PEMT 的活性。笔者猜测绞股蓝总苷改善了PEMT 的功能，促进PE 向PC转换，PC 升高促进PC 向PS 转换，同时增加VLDL输出，减轻肝内TG 堆积。同时，笔者还发现2 种PA 经绞股蓝总苷干预后发生了显著变化。先前研究显示，PA 可通过调节哺乳动物雷帕霉素复合体的靶点来损害胰岛素信号转导[13]。此外，PA（di16∶0）可下调胰岛素信号转导[14]。这些发现表明，一些PA 可引起肝脏胰岛素抵抗，并加重NAFLD。本实验中，绞股蓝总苷可能通过调节PA，减轻胰岛素抵抗，进而减轻NAFLD。

SM 是SP 中含量最丰富的脂质。与野生型对照相比，SGMS2 基因（SM 合成酶基因）缺乏的小鼠饲以高脂饮食后，降低了SM 水平和体质量，并提高了胰岛素敏感性[15]。许多参与SM 合成的酶可能是治疗代谢紊乱潜在的治疗靶点[14]。本实验中，绞股蓝总苷逆转了NAFLD 小鼠SM（d18∶1/18∶3）水平。绞股蓝总苷可能通过影响相关酶的活性，降低了SM 水平，进而改善NAFLD。

除GP、SP 外，GL 在NAFLD 的发展中也起着重要作用。甘油脂代谢中的甘油脂/游离脂肪酸循环在面对高脂血症时通过脂解和β 氧化来分解脂类，从而防止肝脏脂肪变性。NAFLD 的特点是肝细胞中TG的过度沉积。临床研究表明，NAFLD 患者的TG 水平显著高于正常人，且升高水平与胰岛素抵抗正相关[16]。尽管本研究4 组动物的TG 种类差异不大，但模型组肝脏TG 含量显著升高，绞股蓝总苷组与奥贝胆酸组显著降低。在本研究中，绞股蓝总苷干预后NAFLD小鼠MGDG（38∶5）显著升高。然而，不同种类的MGDG 如何影响脂代谢或涉及的作用机制知之甚少。本实验中绞股蓝总苷对NAFLD 小鼠相关脂质调节作用的机制也不清楚，需今后开展相关研究进一步论证。

奥贝胆酸是法尼醇X 受体（FXR）激动剂，越来越多的证据提示NAFLD 的发生与FXR 功能异常密切相关，FXR 为NAFLD 的重要治疗靶点[17]，有研究发现，奥贝胆酸能明显改善NAFLD 患者的病理学特征，显示出治疗NAFLD 的潜在价值[18]。本研究结果显示，绞股蓝总苷和奥贝胆酸均能有效改善NAFLD小鼠的肝组织病理变化，降低肝脏TG 含量和血清ALT、AST 活性，能有效改善NAFLD。绞股蓝总苷治疗NAFLD 的效果与奥贝胆酸相当，提示绞股蓝总苷是一个有效治疗NAFLD 的候选药物，值得今后进一步深入研究。