昆布多糖通过调节巨噬细胞极化延缓肺纤维化研究

张 波，苑艳丽，李玉彤，薛 涛，刘言娟，邵凤丽*，辛 杰，李新朋*

昆布多糖通过调节巨噬细胞极化延缓肺纤维化研究

张 波1，苑艳丽2，李玉彤1，薛 涛1，刘言娟1，邵凤丽1*，辛 杰1，李新朋1*

1. 临沂大学，山东 临沂 276000 2. 上海中医药大学，上海 201203

探索昆布多糖基于调节巨噬细胞极化抑制肺纤维化的作用机制。将昆布中提取的硫酸多糖经自由基降解，得到低相对分子质量昆布多糖（low molecular weight fucoidan，LMWF），并通过高效液相色谱测定了其单糖结构组成。通过免疫组化检测肺纤维化小鼠与LMWF治疗组小鼠M2巨噬细胞极化生物标志物的表达，并通过Western blotting和qRT-PCR检测M1/M2标志物的表达。分别用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）联合γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）和白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）诱导MH-S细胞，构建体外M1和M2巨噬细胞极化模型，探索LMWF调节巨噬细胞极化延缓肺纤维化的作用机制。LMWF可显着降低肺纤维化小鼠肺组织中M1/M2巨噬细胞标志物的表达（＜0.05、0.01、0.001）。同样，LMWF可有效抑制细胞模型中M1和M2型标志物的表达（＜0.05、0.01、0.001）。LMWF可以通过早期抗炎作用调节M1巨噬细胞极化，并在后期通过抑制M2巨噬细胞极化有助于减少纤维化。

昆布；低相对分子质量多糖；肺纤维化；MH-S细胞；巨噬细胞极化

肺纤维化是一种以病因不明的慢性进行性纤维化间质性肺炎为特征的疾病[1-2]。当发生肺损伤时，肺间质细胞会分泌胶原蛋白进行修复，但如果修复过度，即成纤维细胞过度增殖，细胞外基质大量积聚，就会形成肺纤维化。肺纤维化的发病机制包括成纤维细胞活化、细胞自噬能力下降、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）信号通路的激活与免疫失衡。近年来，对肺纤维化发病机制的研究已不再局限于肺泡损伤相关的发病机制。肺纤维化很可能由内源性和外源性细胞应激引起，导致成纤维细胞活化、肺泡结构破坏、细胞外基质沉积、气体交换障碍和呼吸衰竭[3]。而巨噬细胞参与了肺纤维化的整个发病过程，不同表型的巨噬细胞对肺纤维化有不同的影响[4]。另一方面，巨噬细胞的极化受到微生物信号、组织特异性诱导、细胞因子和其他因素的调节[5]。当巨噬细胞极化为不同的亚型时，它们受到不同信号通路的调节[6]。在肺纤维化的不同阶段，巨噬细胞分化为不同的亚型。巨噬细胞的表型极化很可能是肺纤维化发生和发展的机制之一[7]。

研究表明，巨噬细胞的极化影响肺纤维化的发展进程[8]。在肺纤维化的早期，即肺泡炎症阶段，肺巨噬细胞极化为M1型[9]，在肺纤维化晚期，即纤维化修复阶段，巨噬细胞极化为M2亚型[10-11]。炎症性巨噬细胞通常表现为M1激活型，分泌一氧化氮（nitric oxide，NO）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、白细胞介素（interleukin，IL）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等[12]。此时，M1巨噬细胞也会分泌基质金属蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP2）和MMP9，促进细胞外基质的降解，有利于炎症细胞浸润受损组织。当炎症持续时，M1巨噬细胞改变了它们对炎症的反应方式，募集Th17细胞和中性粒细胞，导致持续的组织损伤[13-14]。而M2巨噬细胞的激活也与肺纤维化的发展密切相关。研究指出M2巨噬细胞在小鼠纤维化模型和人类肺纤维化中发挥着重要作用[15]，它们可以产生纤维化介质。除了纤维化作用外，肺纤维化患者巨噬细胞表型的变化也可以解释为什么患者经常肺部感染，导致肺衰竭并最终死亡。因此，抑制M2巨噬细胞表型是肺纤维化的潜在治疗策略[16]。

昆布为海带科植物海带Aresch.或翅藻科植物昆布Okam.的干燥叶状体，具有消痰软坚散结、利水消肿等功效。昆布多糖是昆布主要活性成分之一，药理活性丰富，而低相对分子质量昆布多糖（low molecular weight fucoidan，LMWF）是一种主要由岩藻糖组成的硫酸多糖，在肺纤维化小鼠模型中已经显示出抑制作用[17-18]。LMWF可以阻断ROS以抑制肺纤维化[19]，但先前的研究尚未探讨LMWF作用于肺泡巨噬细胞的机制。因此，本研究旨在阐明LMWF是否能作用于肺泡巨噬细胞的极化以延缓肺纤维化。

1 材料

1.1 动物与细胞

SPF级雄性C57BL/6小鼠，体质量（22±2）g，购自中楚恒通生物科技有限公司（济南），许可证号SCXX（鄂）2017-0012，动物实验已获得临沂大学医学院动物伦理委员会的批准（批准号LYU20200106）。

小鼠肺泡巨噬细胞系（MH-S细胞）购自济南中楚生物科技有限公司。

1.2 药材

昆布采摘于青岛地区，经临沂大学辛杰副教授鉴定为翅藻科植物昆布Okam.的干燥叶。

1.3 药品与试剂

乙醇（分析纯，批号YD20210421）购自天津市永大化学试剂有限公司；Tris-HCl缓冲液（批号20180807）、CCK-8试剂盒（批号20210413）、胰蛋白酶（批号20210623）、RIPA裂解液（批号20210521）、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ，批号20220410）、2 mmol/L-谷氨酰胺（批号20210514）、双抗（批号20220319）、RPMI 1640培养基（批号20220401）购自北京索莱宝生物科技有限公司；精氨酸酶-1（Arginase-1）抗体（批号64q4824，稀释比例1∶1000）、TNF-α抗体（批号73g3336，稀释比例1∶1000）、β-actin抗体（批号12w2944，稀释比例1∶3000）、TGF-β1抗体（批号20r6523，稀释比例1∶1000）、抵抗素样分子α（found in inflammatory zone 1，Fizz-1）抗体（批号85d1712，稀释比例1∶1000）购自Affinity Biosciences公司；CD163抗体（批号20211110）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗体（批号20211110）、CD86抗体（批号20220210）购自武汉基因美生物科技有限公司，稀释比例1∶500；YM-1抗体（批号ab93034）购自英国Abcam公司，稀释比例1∶1000；山羊抗兔IgG二抗（批号56j9958）、山羊抗鼠IgG二抗（批号19z2345）购自Affinity Biosciences公司，稀释比例1∶5000；引物购自生工生物工程有限公司；SYBR Green One Step qPCR试剂盒（批号U28220）购自翊圣生物科技有限公司；Prime-Script RT试剂盒（批号016100）购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批号S11060）购自上海源叶生物科技有限公司）；IL-4（批号200-04）购自派普泰克生物科技（苏州）有限公司；-岩藻糖标准品（批号E1822041）购自上海阿拉丁生物科技股份有限公司；博莱霉素（批号193507）、10%胎牛血清（批号2164724）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；泼尼松（批号LA21243）购自浙江仙琚制药有限公司。

1.4 仪器

041BR325717型凝胶电泳仪（美国Bio-Rad公司）；1260型高效液相色谱仪（瑞士Agilent公司）；Light Cycler 96型实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）；5200型全自动化学发光成像仪（上海天能仪器有限公司）。

2 方法

2.1 昆布多糖化学组成

采取水提醇沉法提取昆布多糖。昆布加入10倍量纯水，100 ℃提取2 h，提取液经硅藻土滤过，滤液减压浓缩，浓缩液与乙醇按体积比1∶4沉淀[20]，沉淀烘干得粗多糖。通过自由基降解（H2O2-Vc 1∶1，30 mmol/L），70 ℃降解2 h，氢氧化钠终止反应，反应液浓缩后乙醇沉淀得到LMWF。借助CL-6B柱洗脱，用氯化钠作为洗脱剂，得到1.0 mol/L NaCl洗脱组分（已有研究发现该组分对肺纤维化具有更好的抑制活性[18]）。基于3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮柱前衍生化后的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析LMWF的主要单糖成分[21]。用苯酚-硫酸法测定总糖含量。用氯化钡-明胶法分析硫酸盐含量[22]。半胱氨酸盐酸盐-硫酸法用于测定LMWF的岩藻糖含量，以-岩藻糖作为标准品[23]。

2.2 动物分组、造模与给药

动物实验样品来自前期实验研究[19]：小鼠随机分为假手术、模型组及LMWF低、中、高低剂量（25、50、100 mg/kg）组和泼尼松（3 mg/kg）组，每组12只。前期采用预实验确定造模方法：小鼠ip 1%戊巴比妥钠麻醉后，行气管切开术，造模组小鼠气管内慢滴注博莱霉素（博来霉素配制成溶液，无菌滤过，3.5 mg/kg，滴加1 mL），假手术组小鼠气管内滴注等体积的生理盐水作为对照。术后缝合伤口，消毒后将麻醉苏醒后的小鼠送回动物房，自由饮水进食，注意保温；于博莱霉素诱导后3、7、14、21、28 d处死各组存活小鼠，取肺组织进行苏木素-伊红（HE）染色观察其病理改变，初步判断炎症及纤维化改变，并采用Masson染色及天狼星红染色观察胶原沉积，确定小鼠肺纤维化进展阶段和造模时间（Masson和天狼星红染色出现胶原沉积，纤维化样改变，认为造模成功）。LMWF用无菌蒸馏水溶解，采用ip给药，实验周期28 d（由预实验确定）。

2.3 M2型巨噬细胞标志物表达

取小鼠肺组织石蜡切片进行免疫组化检测，观察Arginase-1、Fizz-1、YM-1的表达和定位。将小鼠肺组织在液氮中研磨以提取蛋白，并用BCA试剂盒定量[24-25]。采用Western blotting检测M2生物标志物（Fizz-1、Arginase-1、YM-1、TGF-β1）的表达，使用Image J软件分析差异。

2.4 qRT-PCR检测M1与M2型巨噬细胞标志物表达

按照试剂盒说明书提取小鼠肺组织中总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。检测小鼠肺组织中、、、、、、、、Toll样受体4（Toll-like receptor 4，）和一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，）的基因表达[26]。引物序列见表1。

2.5 CCK-8检测细胞活力

MH-S细胞用含10%胎牛血清、2 mmol/L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。细胞以2×103/孔接种到96孔板中，与不同质量浓度（0、50、100、200、400、800、1000 μg/mL）的LMWF共培养24 h。加入CCK-8并培养1 h，采用分光光度计测定450 nm处的吸光度（）值。

2.6 昆布多糖作用浓度筛选

以2×103/孔接种MH-S细胞，IL-4（20 ng/mL）诱导48 h构建M2极化模型[27-28]，同时用不同质量浓度（100、200、400、800、1000 μg/mL）的LMWF处理，另设置不含药物的对照组。

用IFN-γ（20 ng/mL）联合LPS（10 ng/mL）诱导MH-S细胞24 h，构建M1型极化模型[29]，同时用不同质量浓度（25、50、100、200、400、800 μg/mL）的LMWF处理细胞，另设置不含药物的对照组。用CCK-8试剂盒检测细胞活力以筛选有效浓度。

表1 巨噬细胞标志物引物序列

Table 1 Macrophage marker primer sequences

基因引物序列 (5’-3’) Arginase-1F: CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG R: GGAGCTGTCATTAGGGACATCA Fizz-1F: CCAATCCAGCTAACTATCCCTCC R: CCAGTCAACGAGTAAGCACAG IL-10F: GCTCTTACTGACTGGCATGAG R: CGCAGCTCTAGGAGCATGTG YM-1F: GCAAGACTTGCGTGACTATGAA R: AACGGGGCAGGTCCAAA TGF-β1F: ACGTCACTGGAGTTGTACGG R: GGGGCTGATCCCGTTGATT CD86F: GAGCTGGTAGTATTTTGGCAGG R: GGCCCAGGTACTTGGCATT TNF-αF: CCTGTAGCCCACGTCGTAG R: GGGAGTAGACAAGGTACAACCC IL-6F: TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC R: TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC NOS2F: GGAGTGACGGCAAACATGACT R: TCGATGCACAACTGGGTGAAC TLR4F: TTTGACACCCTCCATAGACTTCA R: GAAACTGCAATCAAGAGTGCTG β-actinF: CCTCTATGCCAACACAGT R: AGCCACCAATCCACACAG

2.7 昆布多糖调节巨噬细胞极化

MH-S细胞以1×105/mL接种于6孔板，IL-4（20 ng/mL）诱导48 h，并用不同质量浓度（200、400、800 μg/mL）的LMWF处理细胞。用IFN-γ（20 ng/mL）联合LPS（100 ng/mL）诱导，并用不同质量浓度（200、400、800 μg/mL）的LMWF处理细胞。于显微镜下观察细胞形态并拍照。按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析，检测、、、、、、、、、胶原（）、纤维连接蛋白（fibronectin，）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，）的基因表达，引物序列见表1、2。提取细胞总蛋白并进行定量，采用Western blotting检测Fizz-1、Arginase-1、YM-1、TGF-β1、CD163、iNOS、TNF-α和CD86蛋白表达。

2.8 统计学分析

表2 纤维化标志物引物序列

Table 2 Fibrosis marker primer sequences

基因引物序列 (5’-3’) collagenF: ATGGATTCCCGTTCGAGTACG R: TCAGCTGGATAGCGACATCC FNF: AAGACCATACCTGCCGAATG R: GAACATGACCGATTTGGACC α-SMAF: GTGACTCACAACGTGCCTATC R: CTCGGCAGTAGTCACGAAGC β-actinF: CCTCTATGCCAACACAGT R: AGCCACCAATCCACACAG

3 结果

3.1 昆布多糖化学组成

CL-6B色谱柱对降解后的昆布多糖进行分离。梯度洗脱（0～2 mol/L NaCl）得到2个洗脱组分（F0.5和F1.0），收集F1.0组分（图1-A）。尽管F1.0的化学结构已经明确[30]，但由于其基本化学组成与昆布的来源略有不同，本研究仍然重新测试了F1.0的基本化学组成。单糖成分分析发现，岩藻糖是主要成分，其次是半乳糖和葡萄糖醛酸（图1-B）。相对分子质量测试显示为9801（图1-C）。化学成分测试结果显示，总糖、岩藻糖、糖醛酸、硫酸根质量分数分别为52.53%、38.75%、2.98%、34.33%，半乳糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸物质的量比为0.03∶0.01∶0∶0.01∶0.01∶1∶0.02。

3.2 小鼠肺组织M2型巨噬细胞标志物蛋白表达

免疫组化染色结果（图2-A）显示，Arginase-1、Fizz-1和YM-1在肺纤维化小鼠肺组织中的表达显着增加（＜0.001），而M2巨噬细胞极化标记物在LMWF处理的小鼠肺组织中表达水平显着降低（＜0.01、0.001）。通过Western blotting检测M2巨噬细胞极化生物标志物（图2-B），结果显示LMWF在抑制生物标志物表达方面具有良好的稳定性，显著降低了Fizz-1、Arginase-1、YM-1和TGF-β1表达（＜0.05、0.01、0.001）。此外，阳性对照药物泼尼松对M2巨噬细胞极化生物标志物的表达有良好的抑制作用，但对YM-1表达没有明显的抑制作用。

3.3 小鼠肺组织M1和M2型巨噬细胞生物标志物基因表达

为了研究LMWF是否可以调节巨噬细胞极化，检测了小鼠肺组织中M1和M2极化生物标志物的mRNA水平。如图3所示，与假手术组比较，模型组小鼠肺组织中M2型标志物、、和基因表达水平均显著升高（＜0.001），而LMWF能够减少M2型巨噬细胞标志物表达（＜0.01、0.001）。同时，LMWF也降低了表达（＜0.001）。此外，LMWF可降低M1型生物标志物、、、、表达（＜0.01、0.001）。

A-梯度洗脱曲线 B-单糖组成图谱（1-甘露糖，2-鼠李糖，3-葡糖糖醛酸，4-葡萄糖，5-半乳糖，6-木糖，7-岩藻糖，8-核糖） C-采用高效液相色谱检测多糖相对分子质量组成的图谱

A-免疫组化检测Arginase-1、Fizz-1和YM-1的表达（×400） B-Western blotting检测M2巨噬细胞极化生物标志物的表达 与假手术组比较：##P＜0.01 ###P＜0.001；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，图3同

图3 LMWF对肺纤维化小鼠肺组织中M1和M2巨噬细胞生物标志物基因表达的影响(, n = 3)

3.4 昆布多糖调节M2型巨噬细胞极化

为了探索LMWF对巨噬细胞极化的调节作用，评估了LMWF在IL-4诱导MH-S细胞中的作用。采用CCK-8法检测细胞毒性。结果表明，LMWF（0～1 mg/mL）对MH-S细胞无毒性（图4-A）。IL-4诱导后，细胞形态发生变化，LMWF可以有效调节细胞形态，减少IL-4对细胞的损伤（图4-C）。浓度筛选后，选择200、400、800 μg/mL作为实验浓度（图4-B）。检测M2巨噬细胞极化生物标志物的蛋白和mRNA表达（图4-D、图5），结果表明LMWF可以有效降低M2型生物标志物表达（＜0.05、0.01、0.001）。同时，还检测了纤维化标志物的mRNA表达（图5）。结果表明，IL-4诱导后，纤维化标志物表达增加（＜0.05、0.01），LMWF可以降低纤维化标志物的表达（＜0.05、0.01）。

3.5 昆布多糖调节M1巨噬细胞极化

借助LPS＋IFN-γ诱导MH-S细胞构建M1巨噬细胞极化模型（图6-A）。诱导后细胞的形态学变化并不明显，通过CCK-8试剂盒筛选有效浓度。结果表明，LMWF对抑制炎症显示出效果，并选择了200、400、800 μg/mL作为作用浓度（图6-B）。通过Western blotting和qRT-PCR检测M1巨噬细胞生物标志物的表达（图6-C、D）。结果显示LPS降低了CD163的表达（＜0.001），增强了iNOS、TNF-α、CD86表达（＜0.001）。然而，LMWF可以有效调节其表达（＜0.01、0.001）。qRT-PCR检测也显示出类似的结果。

4 讨论

通过前期研究发现LMWF可以有效地抑制肺纤维化进展，尽管已经证实LMWF可以阻断TGF-β/Smad信号通路和核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）抑制肺纤维化[18-19]，然而对于LMWF抑制肺纤维化的具体作用机制仍需进一步探索。

在肺纤维化早期，多种损伤、刺激可招募循环来源的单核细胞，进入病变组织后分化为巨噬细胞[31]。巨噬细胞分化可形成炎症状态截然不同的2个极端，这一过程称为巨噬细胞极化。经典激活的M1型巨噬细胞和替代激活的M2型巨噬细胞是极化的2个亚群，二者具有截然不同的基因表达谱和蛋白标志物。组织损伤发生的早期，即急性炎症期，坏死凋亡细胞招募促炎性单核细胞聚集，分化为经典激活的M1型巨噬细胞，清除坏死组织并表达大量促炎细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ等。随后促炎信号受到抑制，更倾向于分化为替代激活的M2型巨噬细胞，表达高水平抗炎细胞因子和生长因子如IL-4、IL-10、TGF-β1等，促进上皮和内皮细胞分化增殖，恢复组织形态结构，并促使成纤维细胞发生表型转化，变为肌成纤维细胞，合成分泌细胞外基质，促进组织修复[11]；但如果M2巨噬细胞持续激活，则促进肌成纤维细胞进一步分泌细胞外基质，形成纤维化[32]。

A-LMWF对MH-S细胞活力的影响 (n = 6) B-LMWF对IL-4诱导的MH-S细胞活力的影响 (n = 6) C-LMWF对IL-4诱导的MH-S细胞形态的影响（×200） D-LMWF对IL-4诱导的MH-S细胞M2巨噬细胞极化生物标志物表达的影响 (n = 3) 与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下图同

图5 LMWF对IL-4诱导的MH-S细胞M2型巨噬细胞标志物和纤维化标志物基因表达的影响 (, n = 3)

A-LMWF对LPS/IFN-γ诱导的MH-S细胞活力的影响 (= 6) B-LMWF对LPS/IFN-γ诱导的MH-S细胞形态的影响（×200） C--LMWF对LPS/IFN-γ诱导的MH-S细胞M1巨噬细胞极化生物标志物蛋白表达的影响 (= 3) D-LMWF对LPS/IFN-γ诱导的MH-S细胞M1巨噬细胞生物标志物基因表达的影响 (= 3)

A-effect of LMWF on viability of LPS/IFN-γ-induced MH-S cells (= 6) B-effect of LMWF on morphology of LPS/IFN-γ-induced MH-S cells (× 200) C-effect of LMWF on M1 macrophage polarization biomarkers protein expressions in LPS/IFN-γ-induced MH-S cells (= 3) D-effect of LMWF on polarization biomarkers of M1 macrophage biomarkers gene expressions in LPS/IFN-γ-induced MH-S cells (= 3)

图6 LMWF对LPS/IFN-γ诱导的MH-S细胞M1型巨噬细胞标志物表达的影响

Fig. 6 Effect of LMWF on M1 macrophage polarization biomarkers expressions inLPS/IFN-γ-induced MH-S cells

为阐明LMWF通过巨噬细胞极化抑制肺纤维化的机制，本研究通过Western blotting、qRT-PCR和免疫组化法检测M2巨噬细胞生物标志物（Arginase-1、Fizz-1、YM-1和TGF-β1）在肺组织中的表达水平。结果发现LMWF可以有效调节其表达水平，表明LMWF可以通过调节M2巨噬细胞的极化来抑制肺纤维化的发展。在肺纤维化晚期，M2巨噬细胞占主导地位，而最关键的调节因子是TGF-β1。LMWF可以有效地阻断其分泌，对抑制肺纤维化过程至关重要。此外，炎症是肺纤维化的早期临床表现，这也是本研究检测炎症因子表达的原因。研究发现，炎症因子和M1巨噬细胞生物标志物在qRT-PCR结果中也出现高表达，而LMWF可以有效降低其表达，表明LMWF是可以通过早期抗炎作用和晚期调节M2巨噬细胞极化来抑制肺纤维化。

随后通过体外实验验证其作用机制。首先，用IL-4诱导MH-S细胞，构建M2巨噬细胞极化模型。发现IL-4处理后细胞的形态学发生明显变化。Western blotting和qRT-PCR结果显示，M2巨噬细胞生物标志物的表达增加，而LMWF可以有效降低其表达，尤其是降低TGF-β1表达。这也表明LMWF可以调节M2巨噬细胞的极化，体内实验的结果得到了验证。此外，研究发现IL-4诱导后、和mRNA的表达增加，LMWF干预后纤维化标志物表达明显降低。

本研究通过LPS和IFN-γ联合诱导MH-S细胞，构建M1巨噬细胞极化模型。发现LMWF可以减少炎症因子（iNOS和TNF-α）的分泌，并减少炎症的表达。表明LMWF可以通过其抗炎作用有效阻断M1巨噬细胞的极化并抑制炎症的发展，与本课题组前期研究结果一致[19]。结合体外实验研究证实LMWF可以调节M1/M2巨噬细胞的极化，抑制炎症的发展，阻断纤维化过程，并在晚期阻断M2巨噬细胞的极化和抑制TGF-β1表达。本研究结果表明LMWF可以通过调节M1/M2巨噬细胞的极化来抑制肺纤维化。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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polysaccharides delays pulmonary fibrosis by regulating macrophages polarization

ZHANG Bo1, YUAN Yan-li2, LI Yu-tong1, XUE Tao1, LIU Yan-juan1, SHAO Feng-li1, XIN Jie1, LI Xin-peng1

1. Linyi University, Linyi 276000, China 2. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

To exploring the mechanism ofpolysaccharides in inhibiting pulmonary fibrosis by regulating macrophage polarization.Low molecular weight fucoidan (LMWF) was obtained by free radical degradation of sulfated polysaccharide extracted from, and its monosaccharide structure was determined by high performance liquid chromatography. The expressions of polarized biomarkers in M2 macrophages of pulmonary fibrosis mice and LMWF treated mice were detected by immunohistochemistry, and the expressions of M1/M2 markers were detected by Western blotting and qRT-PCR. Lipopolysaccharide (LPS) combined with interferon-γ (IFN-γ) and interleukin-4 (IL-4) were used to induce MH-S cells respectively, and the polarization models of M1 and M2 macrophageswere constructed to explore the mechanism of LMWF in regulating macrophage polarization and delaying pulmonary fibrosis.LMWF significantly decreased the expressions of M1/M2 macrophage markers in lung tissue of mice with pulmonary fibrosis (< 0.05, 0.01, 0.001). Similarly, LMWF effectively inhibited the expressions of M1 and M2 markers in cell model (< 0.05, 0.01, 0.001).LMWF can regulate the polarization of M1 macrophages through anti-inflammatory effect in the early stage, and help to reduce fibrosis by inhibiting the polarization of M2 macrophages in the later stage.

Okam.; low molecular weight fucoidan; pulmonary fibrosis; MH-S cell; M1/M2 macrophages polarization

R285.5

A

0253 - 2670(2023)17 - 5619 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.015

2023-04-13

山东省自然科学基金联合基金资助项目（ZR2021LZY030）；临沂大学大学生创新创业训练计划项目（X202210452199）

张 波，副教授，研究方向为中药鉴定与质量评价。E-mail: zhangboyxy@lyu.edu.cn

李新朋，副教授，研究方向为中药多糖活性评价。Tel: (0539)7258639 E-mail: lixinpeng513@126.com

邵凤丽，副教授，研究方向为海洋化学。E-mail: shaofengli@lyu.edu.cn

[责任编辑 李亚楠]