胎儿颈项透明层增厚的产前诊断研究进展

贾玮玮, 张 庆, 王 冰

(郑州大学第二附属医院 妇产科, 河南 郑州, 450014)

随着产前筛查及诊断技术的快速发展,无创、直观、无致畸作用、可重复的超声检查不仅可以检出明显的结构异常,还可检出微小的、一过性非特异性改变的超声软指标[1]。颈项透明层(NT)厚度测量是妊娠11～13+6周胎儿超声检查的常规项目。NT增厚被认为是一种与遗传学异常、结构异常及其他病理状况有关的超声标记物[2]。随着产前遗传学技术研究的不断发展,与胎儿NT增厚有关的产前诊断方法也在不断进步。本文就胎儿NT增厚的产前诊断的研究进展予以综述。

1 NT的定义及生理机制

NT指妊娠早期(11～13+6周)检测出的胎儿颈后皮下积液,超声表现为颈后检出无回声区。由于此时期胚胎的淋巴系统发育尚不完善,颈项部的淋巴管内会一过性地积聚少量的淋巴液,形成暂时的颈项透明层。而妊娠14周以后,胎儿淋巴系统的迅速发育会使颈部淋巴管与颈静脉窦之间相通,将积聚的淋巴液疏散至血液系统,颈后积液也会逐渐消散[3]。

2 NT测量的异常范围

在妊娠11～13+6周期间, NT厚度会因胎儿头臀长(45～84 mm)的变化而变化。既往研究[4]认为当头臀长分别为45 mm与84 mm时, NT厚度的中位数分别为1.2 mm与1.9 mm, 第95百分位则分别为2.1 mm及2.7 mm, 而第99百分位数为3.5 mm并未随头臀长变化。然而HUI L S等[5]近年来对超过8万名NT增厚胎儿的研究表示, 3.5 mm与第99百分位、3.0 mm与第95百分位之间的关系并不明确,提出中位数的1.9倍是更合适的阈值。相关研究[4]显示,与将NT增厚的截断值定义为2.5 mm相比,定义为3.0 mm、3.5 mm时致病性染色体异常的漏诊率分别为2.26%及4.52%。

目前国内外各产前诊断中心对于NT异常范围的具体截断值仍存在争议。国际妇产科超声学会并没有明确NT增厚范围的严格定义,英国胎儿医学基金会采用第95百分位数作为标准,美国妇产科医师学会(ACOG)和母胎医学学会则认同3.0 mm或第99百分位的阈值[6-7], 方法并不统一。当前中国临床上大多将固定的数值如NT≥2.5 mm或3.0 mm作为截断值[4, 7], 也有部分机构采用高于第95百分位为异常标准[8]。因各地区及人群的特异性与差异性,中国尚未有与NT最佳界值有关的权威数据研究。毋庸置疑的是在孕早期的不同时期应使用不同的截断值来判断NT是否异常才更具有特异性以及敏感性。

3 NT增厚的形成机制

3.1 头颈部淋巴管发育障碍

正常胎儿在14周后颈项透明层应消退,如果胎儿淋巴系统发育不良,积聚在颈部的淋巴液不能及时连通颈部静脉窦的进行引流,导致NT增厚显著[3]。

3.2 心脏系统异常

研究发现,当共同参与心脏及淋巴系统发育的基因(如血管内皮生长因-A, 活化T细胞因子等)发生突变时可能会引起颈部积液及多种胎儿心脏异常。相关基因主要编码内皮细胞, BEKKER M N等[9]认为内皮损伤会导致先天性心脏畸形的胎儿NT增厚。

3.3 细胞外间质成分改变

与染色体异常胎儿皮肤免疫组织化学的相关研究[8]显示,编码组成蛋白的21、18及13号染色体基因数量的变化,会特异性地增加细胞外间质中的透明基质成分,可将大量的细胞外液吸附至颈部皮肤发生海绵状的改变。

3.4 其他

头颈部血管过度充盈导致静脉回流障碍时同样可导致淋巴液积聚于颈项部,如横膈膜缺损时腹腔脏器进入胸腔使胸腔压力增高导致头颈部静脉充血[10]; 高动力血流循环(如低蛋白血症胎儿)也可导致胎儿水肿引起NT增厚[11]。同时相关研究[12]提出先天性感染可能会导致心肌功能或造血功能异常,从而引起NT增厚。

目前,颈项透明层增厚的病理生理基础尚不完全清楚,NT增厚可能由一种或多种机制共同作用形成。

4 NT增厚的临床意义

4.1 与遗传学异常的关系

自20世纪90年代 NICOLAIDES K H等[3]提出NT增厚在提示染色体异常方面的遗传学价值,近年来相关研究逐渐深入,与NT增厚相关的染色体异常种类被不断完善,而随NT值的增加染色体异常的发生率也随之上升,袁小波等[13]指出,在NT厚度分别为<2.0 mm、2.0～<2.5 mm、2.5～<3.5 mm以及≥3.5 mm的不同分组中,胎儿染色体异常的检出率分别为5.2%、40%、48%、66.67%。

4.1.1 染色体数目异常: 与NT增厚最密切的染色体数目异常为21-三体综合征,此外, 13-三体、18-三体、性染色体数目异常、多倍体等也可与NT增厚有关。MINNELLA G P等[14]肯定了NT增厚与胎儿染色体非整倍体数目异常之间相关性及临床意义,尤其是当NT增厚合并系统结构畸形、生长发育异常以及静脉导管a波倒置等其他超声异常时。

4.1.2 染色体结构异常: 染色体结构异常包括染色体部分缺失、重复、易位、倒位、插入、等臂以及环形染色体等。染色体结构异常同样与胎儿NT增厚密切相关。由于早期技术的局限性,产前诊断仅可检出较大片段的染色体结构异常且无法精准定义其来源及致病性质。对NT增厚而染色体核型正常胎儿的深入研究[15]发现,由于长度低至1 kb以上的染色体拷贝数变异(CNVs)引起的染色体微缺失或微重复结构异常,部分胎儿在发育过程中同样会出现系统结构异常或生长发育异常。CNVs结果一般参照美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)和临床基因组资源进行解读,目前分为5类: 致病性CNVs、可能致病性CNVs、临床意义不明性(VUS)CNVs、可能良性CNVs和良性CNVs。相关研究[16]在NT增厚胎儿中利用CNVs检测技术可检出腭心面综合征、Williams-Beuren综合征等已知综合征,这些综合征可能出现智力低下、心脏畸形、特殊面容等不同临床症状。

4.1.3 单基因疾病: 近年来,随着产前诊断技术的迅速发展,NT与单基因疾病的相关性研究也逐渐深入。许多遗传综合征如Noonan综合征、脊髓性萎缩症以及先天性肾上腺增殖症等与胎儿NT增厚有着密切的关系[17]。与其他罕见遗传综合征相比,与NT增厚有关的相当一部分单基因疾病与RASopathy家族密切相关,这组遗传疾病被统称为RAS病,是由RAS/丝裂原活化蛋白激酶信号通路的失调引起的,通路中包含有超过20个相关基因,包括Noonan综合征等,会出现较为典型的产前超声表型,包括NT增厚、皮下积液、心脏异常等[18], 通常需要使用带有定制基因面板的下一代测序或带有目标数据分析的外显子组或基因组测序进行诊断检测,如果不合并重大的结构异常,部分异常胎儿无法在产前得以发现[19]。

4.2 与胎儿结构异常的关系

NT增厚与胎儿结构畸形密切相关,与心血管系统及骨骼系统关系最为密切。即使有些相关遗传学检查正常,NT增厚也可能会增加结构异常的风险。相关研究[20]认为当排除胎儿染色体非整倍体异常时, NT增厚可能会导致更高的结构异常风险。由于NT厚度的截断值、人群年龄及家族史等不同,不同研究所得到的主要畸形的发生率存在差异。BOUTOT M等[2]、谢思培等[21]研究发现排除整倍体异常后NT增厚胎儿的结构畸形发生率分别为28.7%、28.25%。相关研究[22]显示当NT值分别为3.5～<4.5 mm、4.5～<5.5 mm、5.5～<6.5 mm以及≥6.5 mm时,胎儿结构畸形的发生率分别为15.2%、23.4%、34.5%以及43.0%。

4.2.1 心脏系统: NT增厚是预测胎儿先天性心脏异常的敏感指标,可以在早孕期就筛查出胎儿重大异常及相关并发症[8]。染色体正常胎儿发生NT增厚的常见原因即包括先天性心脏结构异常。同时NT厚度的增加也会导致先天性心脏病的风险上升。

4.2.2 心外结构异常: NT增厚同样与一些心外结构异常相关,包括四肢骨骼系统异常如致死性骨骼畸形、成骨不全症、多指(趾)等; 头面颈部系统如露脑畸形、无脑儿、颜面裂、颈部淋巴水囊瘤等; 胸腹部异常如膈疝、脐膨出等; 双胎异常如连体双胎、双胎输血综合征等[22-24]。

4.3 与胎儿生长发育的关系

NT与胎儿生长发育的关系主要与巨大儿、体质量异常及宫内发育不良有关。相关研究[25-26]显示NT增厚增加了生育巨大儿的风险。KALEM Z等[26]研究发现,随着NT厚度增加,新生儿出生后1 min Apgar评分降低。

5 NT增厚的产前诊断

5.1 超声检查

超声检查既可在诊断染色体异常胎儿方面起重要的筛查作用,也可作为无创产前诊断方法对于胎儿的重大器官或结构畸形直接进行诊断。妊娠早期胎儿NT测量联合系统结构超声检查可以提高出生缺陷的总检出率。染色体正常及异常的胎儿均可发生超声异常。故发现NT增厚后应及时行系统超声检查,特别是重点筛查心脏、骨骼系统等结构异常,同时应行胎儿超声心动图,以评估是否存在其他结构性心脏畸形,可以提供关于出生缺陷的相关诊断信息,对后续进行基因检测也有参考意义。目前中国已经采用NT联合三尖瓣血流以及静脉导管血流频谱进行先天性心脏病的产前检查。

5.2 介入性遗传学检查

由于NT增厚与遗传学异常密切相关, 2020年ACOG在关于胎儿染色体异常筛查的指南中指出,应对NT增厚病例常规行产前遗传学检测[7]。常见的介入性检查包括绒毛、羊水或脐血穿刺等方法,将得到的样本进行遗传学相关检测。

5.2.1 染色体核型分析: NT增厚与染色体非整倍体异常密切相关。染色体核型分析技术需细胞培养且通过光学显微镜来判断是否存在染色体数目以及较大的结构异常(>5～10 Mb), 故周期较长且分辨率有限,但成本相对较低[7]。如今,染色体核型分析仍是产前诊断最常用的方法之一,是检测染色体数目异常的“金标准”。

5.2.2 荧光原位杂交(FISH)及多重连接依赖的探针扩增(MLPA): FISH技术能特异性识别目的核酸序列,可用于对21、18、13-三体、性染色体非整倍体以及多倍体疾病进行检测,但其依赖探针的特异性,不能全面发现染色体倒位复制等其他异常。如今, FISH仍被用于常见染色体非整倍体的快速初步检测,以及评估与疾病相关的特定区域的缺失或重复[27]。MLPA是一种基于多重聚合酶链式反应的检测技术,可以快速高效地检测从完整的染色体到单个外显子的拷贝数变化,但是需要提取样本细胞而不是单个细胞的基因组DNA, 且因探针限制只能够检测临床表型的已知变异。因此,高效筛选致病变异仍是目前产前诊断中需要解决的关键问题。

5.2.3 拷贝数变异测序技术(CNV-seq): CNV-seq是基于下二代测序基础的一种对目标DNA进行低深度全基因组测序的方法,可以将得到的测序结构与参考基因组碱基序列比对后进行信息分析发现异常CNVs。2019年中国专家共识表示此技术在一定程度上可以弥补染色体核型分析和染色体微阵列分析(CMA)技术的不足[28]。然而CNV-seq技术无法检测出三倍体、多倍体、染色体结构重排以及单亲二倍体等杂合性缺失,但可以在平衡易位断裂点处检出是否存在微缺失微重复以及致病性的CNVs。临床实践中,在存在产前诊断需求的孕妇中可将此技术作为一线产前诊断方法[28]。

5.2.4 CMA: CMA作为一项高分辨率检测技术,可在全基因组水平检出亚显微染色体异常以及染色体杂合性缺失。加拿大医学遗传学家学会联合加拿大妇产科医生协会于2018年提出对于NT增厚胎儿推荐使用CMA进行产前诊断[29]。杨丹等[30]关于815例NT增厚胎儿的研究发现核型正常胎儿的致病性CNVs检出率为2.3%。因检测原理以及基因芯片的不同, CMA分为基因组杂交技术以及单核苷酸多态性微阵列技术两大类。前者主要发现相对稍大的重复或者缺失的CNVs; 而后者除检出CNVs外,还可以检测出大多数的单亲二倍体、三倍体以及低水平的嵌合体。但CMA仅能检测芯片探针所覆盖区域的拷贝数情况,不能检出如着丝粒、随体等无法检测的区域,无法检出倒位及低比例嵌合体、平衡异位重排信息以及特定综合征相关的所有相关基因位点异常。当提示胎儿超声结构异常、宫内生长受限、无法排除胎儿存在单亲二倍体变异等情况时建议首选CMA检测[31]。

另外, CMA及CNV-seq中VUS的结果解读仍存在困难。VUS指检出的CNVs在目前已知的数据库和相关资料中无对应片段,且基因功能及与临床表型的相关性尚不明确的判读类型,可加重当事者的焦虑,甚至可能会造成错误的妊娠结局。因为进一步行父母验证的病例数偏少、数据库完善不足、数据判读标准差异以及芯片检测平台等因素,目前对于VUS的检出及判读能力还需不断积累,以进一步提高数据的可信度[7]。

5.2.5 全外显子组基因检测(WES): 部分NT增厚胎儿的核型及拷贝数检测未见异常时,仍存在单基因遗传病的发生风险。虽然外显子只约占人类基因组的1%,而已知的大部分致病突变都位于外显子中。WES是一种基于下一代测序技术的全外显子组基因分析方法,能够捕捉全基因组外显子区域中的DNA,将其富集后进行高通量测序[32]。WES可进行单基因遗传病的检测,具有检测范围广、检出率高等优点。除此之外, WES可能会发现新的致病基因突变位点,创造较高的科研价值,也能帮助临床医生更好地判断预后。由于传统产前诊断遗传学方法的局限性以及WES在儿科中的成功实践,目前WES已被逐渐应用于产前诊断。2020年ACMG发布相关指南,认为对于超声发现胎儿结构异常且CMA检测结果正常的病例,应推荐进一步行产前外显子组检测以排除胎儿单基因变异[33]。GIROLAMO R D等[34]和PETROVSKI S等[35]进行了规模较大的相关研究均提示WES可进一步提高产前诊断胎儿遗传学异常的检出率。目前认为适用于WES产前诊断的指征限于影像学筛查的胎儿结构畸形,包括多发畸形、心血管畸形、骨骼发育异常等。除NT增厚外,提示染色体非整倍体的大多数超声软指标异常如脉络丛囊肿、肠管回声增强等不作为推荐检测项目[36]。

在临床实践中,大多采用将胎儿及父母的样本同时检测的家系测试模式,这种模式可以在节省后续父母验证环节时间的同时得到更准确的结果,但是成本也较高,时间较传统产前诊断方法长。WES可以发现传统产前检查无法发现的相关基因位点异常,能更好地解释胎儿的影像学表型。但是WES检测是基于临床表型导向的一种检测方法,当影像学结果不足或者出现胎儿期无法检出的智力、语言、运动等功能异常时,产前的WES可能导致对相关基因的覆盖并不完全从而出现遗漏或误差[37]。另外, WES获得的大量数据解读存在困难。现有数据库尚不完善,除了与表性相关变异外,可能存在新变异、意义不明以及次要偶然发现等难以解释的情况。另外,除不能检测非编码区变异外, WES并不能够检出其他所有类型的变异,包括拷贝数变异、染色体倒位结构重排等[38], 故仍应该与传统的遗传学检查联合使用。

目前产前诊断中遗传学诊断方法以细胞学核型分析检测为主,并逐渐发展向CNVs检查。目前被广泛应用于临床实践的CNVs检测技术为CNV-seq或CMA,可以明确判断片段大小、来源以及涉及基因。一项有关1 658例NT增厚胎儿的大样本研究[39]指出胎儿染色体数目异常的检出率为15.8%, 行CNVs检测将致病性变异的检出率提高了3.7%, 并提出无论是否孤立存在的NT增厚(≥2.5 mm)胎儿均需接受介入性产前诊断。当前中国临床上已普遍将染色体核型分析技术联合CMA或CNV-seq应用于NT增厚胎儿的遗传学产前诊断以降低染色体异常胎儿的漏诊率,但是也存在一定的局限性。WES可以检测至单基因疾病范围,有着其他传统产前诊断方法无法比拟的范围及深度,但其依赖于胎儿表型且结果解读困难。2022年中国发布相关专家指南指出,由于大量研究表明NT增厚、尤其是>4 mm的胎儿与单基因疾病特别是Noonan综合征的相关风险较高,提出常规产前检查胎儿核型分析+染色体拷贝数变异分析+WES检测的建议[36]。2022年中国相关专家组发表建议指出若NT增厚持续不消退或发展为水肿、孕中期颈部皮肤皱褶增厚等时,可考虑应用WES进行进一步精准检测[40]。XUE S Y等[41]指出在染色体核型分析及CMA均为阴性结果的情况下,约13%的NT增厚胎儿应用WES得到了异常遗传学结果诊断。MELLIS R等[42]研究则提出早孕期孤立性与非孤立性NT增厚胎儿的单基因微小致病性变异检出率分别为1.8%及22.2%, 而早孕期孤立性NT增厚伴中晚孕超声异常胎儿的单基因致病性变异检出率为32.4%, 且检出率随NT厚度增加而升高。故对于NT增厚合并有中晚孕期超声异常的胎儿应适时采用WES进一步提高异常胎儿的检出率,降低出生缺陷率。

6 NT增厚胎儿的预后

相关研究[43-44]显示不良妊娠结局的风险随着NT增厚而增大,包括遗传学异常、重大结构畸形、神经发育迟缓、流产及宫内死亡等,需要密切监测胎儿发展进程并早期采取措施。即使NT增厚与许多胎儿异常有关,但也可见于正常胎儿。在临床咨询时,医师应详细客观地给予孕妇及家属个体化指导,避免盲目引产。TEKESIN I[45]回顾分析了近年来NT增厚胎儿相关数据,经产前诊断排除染色体异常后,健康新生儿活产率为83.7%。PASQUINI L等[44]研究发现,在无系统结构异常、染色体异常以及儿科基础评估异常的情况下, NT增厚胎儿出现神经发育迟缓的概率与正常人群相当。

综上所述, NT超声检查是筛查胎儿染色体异常、结构异常等的敏感指标,在产前诊断中发挥着极为重要的作用。对胎儿NT增厚的孕妇,应尽早行系统超声检查以及侵入性产前诊断排查胎儿结构及遗传学异常。即使传统遗传学检查(核型+CMA/CNV-seq)阴性,仍然可根据系统超声结果及家族史等综合考虑行WES, 提高罕见病的检出率,为NT增厚胎儿的产前诊断及遗传咨询提供更准确的信息。