二套小麦-簇毛麦染色体附加系苗期耐盐性及籽粒硒和叶酸的含量

韩志阳 贾子苗 梁秋菊 王轲 唐华丽 叶兴国 张双喜

（1. 宁夏大学农学院，银川 750021；2. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；3. 宁夏农林科学院农作物研究所，银川 750101；4. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

小麦是我国主要的粮食作物之一，种植面积仅次于玉米和水稻［1]。新中国成立以来，小麦生产取得了长足进步，从1950年的660 kg/hm2到2012年的4487 kg/hm2，年均增产1.9%，总产量增加了6倍多［2]。但是由于过去对小麦产量的过度重视，导致目前小麦品质改良的研究进展相对缓慢。我国小麦品质改良主要集中在中筋和中强筋品种培育，籽粒蛋白质含量与欧美相当，但蛋白质品质不理想，导致加工品质较差［3-4]。另外，随着灌溉农业的发展以及化肥、农药的大量施用，小麦生产区土壤盐渍化和土壤污染等问题频发［5]，迫切需要培育高抗、优质的小麦新品种［6]。

长期以来，小麦的遗传改良主要依赖于小麦种内遗传变异和优良基因的随机组合，可用基因资源的减少直接降低了小麦育种效率和突破性品种的持续培育［7]。将小麦近缘物种中蕴含的优良基因引入小麦，是突破当下小麦育种瓶颈的重要措施。研究表明，黑麦属［8]、山羊草属［9]、簇毛麦属［10]、偃麦草属［11]为小麦锈病和白粉病提供重要抗病基因。除了抗病性之外，小麦野生资源在长期的生存和竞争过程中对各种非生物胁迫也表现出较强的适应能力。黏果山羊草耐热、抗旱和耐盐性较强，粗山羊草耐极端寒冷的性能突出，冰草属中的多数变种对干旱、寒冷和盐碱环境具有适度的耐受性［12-13]。

在所有非生物胁迫中，盐胁迫最为典型，对作物产量的影响最大。通过瞬间盐胁迫和逐步盐胁迫分别鉴定小麦-长穗偃麦草附加系和代换系耐盐性，发现染色体3E、5E与瞬间盐胁迫引起的耐受性相关，染色体3E、4E和5E则与逐步性盐胁迫造成的耐受性相关［14]。单雷等［15]采用体细胞杂交的方式将小麦原生质体与高冰草原生质融合，培育了小麦体细胞杂交品种山融3号，该品种在盐胁迫下产量比对照高22.58%。刘旭等［16]利用小麦与黑麦、延安赖草杂交，从回交后代中选育出小赖麦98-160、小黑麦98-113等6份强耐盐材料。魏景芳等［17]对小麦与多枝赖草杂交后代进行不同生育期耐盐性鉴定，培育出耐盐性较为突出的新品系L88。目前小麦的耐盐基因资源还很缺乏，对小麦近缘植物中耐盐性的挖掘和利用还不够，需要对更多小麦与其近缘种属远缘杂交中间材料进行耐盐性鉴定。

另外，山羊草属籽粒中含有与胚乳硬度有关的蛋白质，可以用于改良小麦的面包烘焙品质；小黑麦籽粒蛋白质含量高达20%，且Zn和Fe的含量较高［18-20]。硒和叶酸作为人体必须营养元素，与人类生命活动和健康息息相关，硒元素和叶酸缺乏会引起许多重大疾病的产生［21]。Fox等［22]和Hawkesford等［23]利用同位素对小麦、大蒜和鱼类进行硒元素标记发现，硒在小麦、大蒜、鱼类中的生物利用率分别为81%、78%和56%，因此小麦是提高人体硒元素利用的最佳选择。但我国富硒小麦研究起步较晚，小麦籽粒硒含量总体较低。据鉴定，河北省120个小麦品种平均硒含量为7.00 μg/100 g［24]，四川省62个小麦品种平均硒含量为3.50 μg/100 g［25]。Riaz等［26]对我国360个小麦品种叶酸含量进行分析，认为基因型和环境条件对叶酸的积累有显著影响，建议根据当地情况筛选叶酸含量较高的小麦品种作为育种亲本。目前为止，还没有对小麦与近缘种属远缘杂交中间材料进行硒元素和叶酸含量研究的报道。

簇毛麦作为栽培小麦的近缘物种，可以在恶劣潮湿的环境中生长，表现出植株长势强、籽粒多、植株分蘖能力强等生长发育特点［27]，对条锈病、秆锈病、白粉病和条状花叶病毒病［28]均表现出较强的抗性，还拥有耐盐、耐寒、抗旱［29-30]等优良性状，是小麦改良的重要基因资源。迄今为止，国际上共收集了300多份不同来源的簇毛麦种质资源，将多个簇毛麦优良基因引入小麦遗传背景中［31-32]，创制了高抗白粉病的小麦-簇毛麦6AL·6V#2S和6DL·6V#4S等易位系，培育了农艺性状优良的扬麦22、金禾1号、宁春66号等抗白粉病小麦新品种［33]，以及农艺性状优良、高抗白粉病、再生能力和转化能力强的Fielder改良系WT48和FL347等［34]，对小麦遗传改良、产业发展、转基因育种和功能基因组研究等具有重要作用。迄今为止，关于利用簇毛麦改良小麦的研究都集中在增强抗病性方面，很少涉及利用簇毛麦改良小麦抗盐性和营养品质。

本研究拟以实验室保存的2套小麦-簇毛麦附加系为材料，进行苗期耐盐性鉴定，以及籽粒中硒元素、叶酸含量分析，明确簇毛麦相关染色体是否携带与耐盐、硒元素含量和叶酸含量有关的基因，为进一步利用染色体工程和分子标记技术将簇毛麦中含有的这些优良基因导入小麦，改良小麦耐盐性及提高小麦籽粒叶酸和硒含量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

小麦-簇毛麦#2二体附加系DA（1-7）V#2由南京农业大学王秀娥教授提供，该套材料中的外源染色体来自簇毛麦#2；小麦-簇毛麦#3二体附加系DA（1-7）V#3为河南农业大学刘文轩教授提供，该套材料中的外源染色体来自簇毛麦#3。以上2套材料的遗传背景均为中国春（CS）。

1.2 方法

1.2.1 耐盐鉴定 在超净工作台内，将小麦成熟种子用70%乙醇灭菌15 min，25%次氯酸钠灭菌25 min，无菌水清洗4-5次；加入适量无菌水，4℃过夜，用25%次氯酸钠灭菌15 min，无菌水冲洗后剥取成熟胚，胚芽朝上，接种在含有NaCl的培养基（1/2 MS+20 g/L蔗糖+2.4 g/L植物凝胶+200 mmol/L NaCl，pH 6.0）上，每个材料接种10个成熟胚，重复3次，共30个成熟胚，置于培养箱（16 h光照/8 h黑暗）中培养3 d；在光照下培养5 d后统计盐胁迫下各个小麦-簇毛麦附加系和对照材料的萌发率，30 d后统计幼苗存活率，测定成活幼苗的株高和根长。

1.2.2 硒含量测定 在装有钢球的离心管中放入2 g小麦成熟种子，在磨样机充分上磨碎，每个材料取0.5 g粉末放入试管中，加入2 mL硝酸溶液，120℃消解30 min，加入去离子水至终体积为15 mL。采用电感耦合等离子体质谱仪测定参试材料的硒含量，计算公式为：样品硒含量（μg/g）=（C×V×F）/M，其中，C表示样品浓度，V表示样品定容体积，F表示样品稀释倍数，M表示样品质量。

1.2.3 叶酸提取和含量测定 每个小麦材料取20粒种子，研磨后，取50 mg粉末于1.5 mL离心管中，加入1 mL提取液（含NaH2PO418.96 mg、NaHPO4H2O 60.85 mg和抗坏血酸钠0.5 g，混合过滤后加入200 μL β-巯基乙醇），混匀，先沸水浴10 min，再立即冰浴10 min。在遮光条件下加入大鼠血清30 μL，混匀后置于37℃烘箱中处理4 h，再次进行沸水浴10 min，冰浴10 min。然后4℃ 13000 r/min离心10 min，取400 μL上清液于新离心管中，4℃ 13000 r/min离心20 min。最后取90 μL底液加入到测样管中，再加入10 μL甲氨蝶呤（methotrexate），进行叶酸含量测定。叶酸衍生物浓度依次记为C1、C2、C3...Cn，单位为ng/mL。样品质量为M，单位为mg，叶酸含量计算公式为：F=F［（C1+C2+C3+C4+ ...Cn）/M]×100，单位为μg/100 g。

2 结果

2.1 盐胁迫对小麦-簇毛麦附加系成熟胚萌发率的影响

将2套小麦-簇毛麦附加系的成熟胚接种在含有NaCl的培养基上，生长10 d后，对不同材料的萌发率进行统计（表1）。在盐胁迫条件下，小麦-簇毛麦#2附加系成熟胚的萌发率为16.67%-43.33%，其中，DA5V#2的萌发率最高，其次是DA6V#2（33.33%），DA1V#2的萌发率最低，但小麦-簇毛麦#2附加系的萌发率均高于对照中国春（6.66%）；小麦-簇毛麦#3附加系的萌发率为26.67%-70.00%，其中，DA3V#3的萌发率最高，其次是DA7V#3（56.67%），DA5V#3最低（26.67%），均显著高于中国春。相对而言，小麦-簇毛麦#2在盐胁迫下的萌发率低于小麦-簇毛麦#3，小麦-簇毛麦#3附加系DA3V#3、DA7V#3和DA2V#3的萌发率均在50.00%以上，表现出较好的苗期耐盐性。

表1 小麦-簇毛麦附加系成熟胚在盐胁迫下的萌发情况Table 1 Germination situation of mature embryos of wheat- Dasypyrum villosum additional lines under salt stress conditions

2.2 盐胁迫对小麦-簇毛麦附加系成熟胚幼苗生长状况的影响

小麦-簇毛麦附加系成熟胚在含有NaCl的培养基上生长30 d后，测定各材料的存活株数、株高和根长。结果（表2）表明，2套小麦-簇毛麦附加系植株存活率均显著高于对照中国春；小麦-簇毛麦#2二体附加系DA（1-7）V#2的平均株高为8.1-15.2 cm（表2，图1-a），其中，DA4V#2的平均株高最高，DA4V#2、DA7V#2、DA3V#2和DA5V#2平均根长均大于对照中国春（8.6 cm）（表2和图1-a）；小麦-簇毛麦#3二体附加系DA（1-7）V#3的平均株高为9.9-16.1 cm（表2和图1-b），DA2V#3最大，DA5V#3最小，只有DA5V#3株高低于对照中国春（表2和图1-b）；DA 2V#3平均根长最大，为3.4 cm。综合2套小麦-簇毛麦附加系的鉴定结果，认为DA2V#3、DA4V#2表现出较好的苗期耐盐性，可以作为小麦耐盐育种的潜在资源。

图1 小麦-簇毛麦附加系在盐胁迫下的生长状况Fig. 1 Growing status of wheat-Dasypyrum villosum additional lines under salt stress conditions

表2 小麦-簇毛麦附加系在盐胁迫下的生长情况Table 2 Growth status of mature embryos of wheat- Dasypyrum villosum additional lines under salt stress conditions

2.3 不同小麦-簇毛麦附加系籽粒硒含量测定分析

7个小麦-簇毛麦#3附加系中，DV2#3的籽粒硒含量为7.60 μg/100 g，高于对照（7.54 μg/100 g），其他6个附加系籽粒硒含量均低于对照，其中，DV7#3最低（6.35 μg/100 g）。小麦-簇毛麦#2附加系籽粒硒含量为6.29-8.47 μg/100 g（图2-a），其中，DV3#2和DV2#2（8.23 μg/100 g）高于对照，DV4#2最低（6.29 μg/100 g）。结果表明，导入簇毛麦染色体后总体上引起小麦籽粒硒含量降低，但附加系DV2#2和DV2#3高于对照中国春，认为簇毛麦2V染色体可能携带籽粒富含硒元素的相关基因。

图2 小麦-簇毛麦附加系籽粒中硒含量的测定Fig. 2 Selenium content analysis in the grains of wheat-Dasypyrum villosun addition lines

2.4 不同小麦-簇毛麦附加系籽粒叶酸含量测定分析

通过测量籽粒叶酸，小麦-簇毛麦附加系#2附加系中，DA6V#2籽粒叶酸含量最高，为26.10 μg/100 g，其次是DA4V#2（20.23 μg/100 g），均显著高于对照中国春（10.98 μg/100 g）；DA7V#2叶酸含量为9.00 μg/100 g，低于中国春（图3-a）。小麦-簇毛麦附加系#3附加系中，DA5V#3最高（16.08 μg/100 g），其次是DA1V#3（14.02 μg/100 g），均高于对照中国春（10.98 μg/100 g），DA3V#3最低（图3-b）。与小麦-簇毛麦#2附加系相比，小麦-簇毛麦#3附加系叶酸含量变化范围较小。差异显著性分析发现，小麦-簇毛麦附加系DA4V#2、DA6V#2叶酸含量与对照中国春的差异达极显著水平，DA3V#2、DA5V#2、DA5V#3与中国春的差异达显著水平。总之，小麦-簇毛麦#3附加系籽粒中的叶酸含量低于小麦-簇毛麦#2附加系，DA6V#2附加系的叶酸含量最高，推测6V#2染色体可能携带促进籽粒叶酸合成的相关基因。

图3 小麦-簇毛麦附加系籽粒中叶酸含量测定结果Fig. 3 Folic acid content results in the grains of wheat-Dasypyrum villosun addition lines

3 讨论

我国盐碱地分布范围广泛，对小麦生产影响较大，需要筛选耐盐性小麦种质资源，培育耐盐性强的小麦品种［35]。由于小麦的耐盐性在成熟期鉴定需要很长时间，因此鉴定小麦耐盐性的研究主要集中在芽期和苗期。赵旭等［36]对4个冬小麦品种进行耐盐性鉴定发现，小麦种子萌发的临界盐浓度为150-200 mmol/L。彭志等［37]、王萌萌等［38]分别对多个小麦品种进行了室内耐盐性鉴定，筛选出一些萌发期耐盐性较好的品种。本研究首次利用成熟胚离体培养对2套小麦-簇毛麦附加系材料进行了萌发期和苗期耐盐性鉴定，与其他鉴定方法相比，组织培养鉴定方式确保一致的环境条件。结果表明，在小麦的遗传背景中引入簇毛麦染色体后，萌芽期对盐胁迫的耐性增强，附加系萌发率均高于对照中国春，尤其DA5V#2、DA3V#3、DA7V#3和DA2V#3等附加系耐盐能力较强，初步认为簇毛麦5V#2、3V#3和2V#3染色体上可能存在耐盐相关基因。

目前对籽粒中硒元素含量的研究和富硒小麦资源的鉴定较少。刘慧等［39]对655个小麦品种的硒元素含量进行检测发现，平均含量为6.46 μg/100 g，春小麦和冬小麦平均硒含量分别为6.75和 6.42 μg/100 g，不同年份间春小麦和冬小麦差异较大。Lyons等［40]对同一小麦品种连续3年进行检测发现，不同年份硒元素含量不同，差异较为明显，可能是因为水分、土壤、光照等环境条件对小麦籽粒中硒元素含量有影响。此外发现，外源施用无机硒盐也能引起小麦硒元素含量的变化［41]。迄今为止，我国依然缺乏富硒小麦品种，需要从小麦近缘种属中挖掘富硒基因资源，促进富硒小麦品种培育。本研究对14个小麦-簇毛麦附加系分别进行籽粒硒含量测定发现，附加系DA2V#2、DA2V#3和DA1V#2籽粒中硒含量显著高于对照中国春，推测簇毛麦2V染色体可能携带与籽粒硒元素积累的相关基因。

小麦籽粒中叶酸含量主要受到基因型的影响。Riaz等［26]对360个小麦品种籽粒中的叶酸含量进行检测后发现，冬小麦和春小麦叶酸含量具有差异，平均含量分别为36.08和43.98 μg/100 g，并且筛选出几个叶酸含量较高的小麦基因型。小麦籽粒中叶酸含量还受到其他因素的影响，其中，贮藏和加工对小麦籽粒叶酸含量的影响较大。中国农业科学院作物科学研究所转基因中心小麦实验室详细研究了小麦籽粒和面粉储藏不同时间，以及面粉不同加工方式（包括面包、馒头、面条）对叶酸含量的影响。结果表明，存贮2个月时面粉中的叶酸含量即出现下降，存贮6个月时叶酸损失率平均为28%；叶酸在籽粒中较为稳定，存贮4个月时叶酸含量开始出现下降，存贮6个月时叶酸损失率平均为17%；存贮8个月时面粉和籽粒中叶酸含量均显著下降，分别为30%和26%；在煮后面条、蒸后馒头和烘焙后面包中叶酸含量分别为1.93-2.29 μg/100 g FW（鲜重）、12.53-19.80和30.01-45.92 μg/100 g FW，分别为面粉中叶酸含量的22%、158%和391%。认为馒头和面包可优先作为叶酸摄入来源，其叶酸含量比面粉中提高了1.5-4.0倍。小麦贮藏和加工虽然导致一定程度的叶酸损失，但仍然有较多的叶酸存在，没有导致存在叶酸的降解［42]。另外，利用转基因技术可以提高小麦籽粒中的叶酸含量。通过农杆菌介导的转基因技术，将大豆、番茄中的叶酸合成相关基因GmGCHI、GmADCS和LeADCS转入小麦，转基因小麦籽粒中的叶酸含量比野生型对照提高了2.3-5.6倍［43]。本研究发现，小麦-簇毛麦附加系6V#2籽粒中叶酸含量的增加最为明显，认为簇毛麦6V#2染色体上可能携带影响叶酸合成的相关基因。

本研究鉴定到簇毛麦5V#2、3V#3和2V#3染色体可能携带耐盐相关基因，2V染色体可能携带与籽粒硒元素积累的相关基因，6V#2染色体可能携带籽粒叶酸合成的相关基因。簇毛麦在全世界有300多种，因为它们起源的地理环境和生态环境的不同，不同来源的簇毛麦在基因组成上存在着多样性和遗传歧化。如对小麦白粉病的抗性，并不是所有簇毛麦都具有抗病基因，其中，簇毛麦#2和#4抗白粉病，簇毛麦#5就不抗白粉病。所以，簇毛麦#2和#3在耐盐及硒和叶酸含量等遗传控制面也会存在差异［44-45]。本研究鉴定的可能与改良小麦耐盐及籽粒硒和叶酸含量相关的簇毛麦染色体以附加系形式存在于小麦遗传背景中，难以直接用于小麦育种和生产，需要进一步培育携带目标基因染色体的代换系和染色体片段的易位系。染色体特异的分子标记可以加速小麦-簇毛麦染色体代换系和易位系的选育。Li等［45]利用转录组测序技术开发了全套鉴定簇毛麦不同染色体臂的特异分子标记，并选育了部分小麦-簇毛麦染色体代换系和易位系，为下一步将簇毛麦不同染色体上携带的耐盐、籽粒硒元素积累和叶酸合成的相关基因以易位系方式导入小麦奠定基础。

4 结论

附加系DA5V#2、DA3V#3和DA2V#3在盐胁迫下萌发、存活和生长状况较好，DA2V#3和DA2V#2平均硒含量较高，DA6V#2平均叶酸含量较高。簇毛麦5V#2、3V#3和2V#3染色体可能存在耐盐相关基因，簇毛麦2V染色体可能存在籽粒富硒相关基因，6V#2染色体可能携带籽粒叶酸合成的相关基因。