三七白及粉通过Nrf2/Gpx4介导的铁死亡改善脑出血型应激性溃疡大鼠的胃黏膜损伤

安 凯, 郭沛然, 孙玉凤

(1.河北省石家庄市人民医院康复医学二病区, 河北 石家庄 050000 2.河北医科大学中西医结合学院, 河北 石家庄 050000 3.河北医科大学第二医院消化内科, 河北 石家庄 050000)

应激性胃溃疡(stress gastric ulcer,SGU)是机体在应激状态下所出现的一种急性胃黏膜病变,临床上常见症状为胃底、胃体部的黏膜表浅溃疡、糜烂或出血[1]。SGU是急危重患者常见的并发症之一,统计显示,有85%以上的重症患者均出现了应激性胃溃疡,其中出血患者占6%～20%。目前颅脑疾病所致的SGU在临床最为常见,研究发现[2],脑出血后机体会产生一系列应激反应,如神经内分泌、免疫和代谢等,这些应激反应通过作用于下丘脑而促进胃泌素及胃酸的分泌,加重胃黏膜屏障功能损害,最终发展为SGU。临床常用H2受体拮抗剂或质子泵抑制剂方法治疗SGU,但临床效果并不理想,近年来中药治疗SGU消化道出血疗效显著。三七具有多种功效,包括活血、祛瘀、镇痛、消肿、补虚强壮等,进而发挥对溃疡面少量渗血的抑制作用,对溃疡组织微循环的改善作用,对坏死组织和炎性水肿吸收的促进作用。白及在中药中是止血、生肌的常用药物,其具有一定的高黏性,通过在胃内形成较厚的膜状物而粘在溃疡面,从而抑制胃蛋白酶、胃酸等对溃疡组织的侵袭,最终对溃疡面的愈合发挥促进作用。在传统中医药方剂中,三七白及粉常见于具有活血化瘀、止血、消肿等功效的复方中,其已有研究证实在抗凝血、抗血小板聚集、促进血管新生等方面具有重要作用[3]。有学者研究证实[4],三七白及粉类方剂联合西药治疗消化性溃疡的效果优于单用西药治疗。但目前关于三七白及粉作用于SGU的机制尚不清楚。铁死亡是一种新的调节性细胞死亡方式,其在临床上常以铁过载和脂质过氧化物累积为主要特征[5]。在铁死亡过程中,核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,Gpx4)是关键调控因子之一,Nrf2和Gpx4的缺失会通过异常的铁代谢和脂质过氧化等导致细胞死亡,其中胃黏膜细胞在胃溃疡疾病中能够起到修复损伤胃黏膜作用[6],因此推测Nrf2/Gpx4通路介导的铁死亡与SGU疾病密切相关。因此本研究从Nrf2/Gpx4通路介导的铁死亡的基础上,探究三七白及粉对脑出血型SGU大鼠胃黏膜损伤的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物:SPF级雄性SD大鼠均购自杭州师范大学,共计60只,体质量200g～220g,生产许可证号SCXK(浙)2021-0004。统一饲养大鼠,动物房内保持室温23℃～25℃,相对湿度50%～60%,保证房间光照12h一循环,昼夜交替。自由摄食饮水。

1.2试剂和仪器:Nrf2特异性抑制剂ML385(美国MedChem Express公司);亚铁离子(Fe2+)检测试剂盒(深圳迈德施生物科技股份有限公司);Nrf2、SLC7A11、Gpx4抗体(武汉艾美捷科技有限公司);多聚甲醛(济南翱翔化工有限公司);苏木精-伊红染色液(北京百奥莱博有限公司);双目立体解剖显微镜(仪景通光学科技(上海)有限公司);TGL-16G-A低温高速离心机(青岛精诚仪器仪表有限公司)。

1.3药物配制:在研钵中研磨中药三七和白及成粉末状,依据比例量取并调均药粉;根据人和动物体药物换算折算所用药量。按照随机数字表法将60只大鼠分为NC组、SGU组、三七白及粉低剂量组(三七白及粉L组)、三七白及粉中剂量组(三七白及粉M组)、三七白及粉高剂量组(三七白及粉H组)、三七白及粉高剂量+Nrf2特异性抑制剂ML385组(三七白及粉H+ML385组),每组10只。制备自体血基底节出血大鼠模型,麻醉大鼠,仰卧位固定大鼠于操作台,去除头顶部的毛发后置于脑立体定位仪上,沿颅顶中线右侧0.5cm眼耳连接线处切开1cm小口,将颅骨皮下筋膜钝性分离。在前卤0.2mm、正中旁开3mm处定位后用颅钻打一直径为1mm的孔。分别抽取各组大鼠200μL尾静脉自体血,立即从颅顶开孔出垂直进针6mm,将自体血用微量泵入右脑基底节内,平分每分钟泵入5μL。自体血泵入完毕,10min后缓慢拔针。逐层缝合皮肤,伤口处涂抹碘伏消毒。NC组大鼠仅在颅顶钻孔不泵入自体血,其余步骤同其他各组相同。神经功能评分2分以上,且肉眼可见大鼠胃黏膜充血、水肿、潮红,胃体部出现多处斑点状糜烂、溃疡及出血,组织病理可见胃黏膜炎细胞浸润、黏膜损伤为造模成功。

1.4给药:术后3d后给药干预,三七白及粉L组、三七白及粉M组、三七白及粉H组大鼠分别灌胃给药2.5g/kg、5.0g/kg、10g/kg的三七白及粉,剂量为1mL/100g;三七白及粉H+ML385组大鼠灌胃10g/kg的三七白及粉,同时腹腔注射DMSO溶解稀释的Nrf2特异性抑制剂ML385 30mg/kg;NC组和SGU组分别给予等量的生理盐水灌胃,1次/日。各组大鼠均连续灌胃14d。

1.5神经功能评分[7]:在脑出血模型制备6h后,使用LongaFZ法进行神经功能评分,2分以上为模型制备成功,评分标准见表1。

表1 神经功能评分

1.6胃黏膜溃疡指数(ulcer index,UI)测定:麻醉并处死大鼠,以1%甲醛溶液灌胃提取整个胃组织,将胃组织固定于1%甲醛溶液中,10min后取出沿胃大弯将整个胃部切开,冲洗胃内容物后铺平,用立体显微镜用目镜测微尺测量胃黏膜损伤长度,计算胃黏膜损伤指数,UI=胃黏膜各处糜烂分值相加的总和,当损伤宽度>1mm时计分按2倍计算,评分标准见表2。

表2 胃黏膜损伤指数(UI)评分

1.7HE染色检测胃组织病理学变化:UI测量后,将胃组织固定于4%多聚甲醛溶液,包埋盒包埋后流水冲洗固定液,不同浓度酒精脱水组织后置于二甲苯中,将透明的组织用石蜡包埋,用切片机切成厚度为5μm的薄片,用苏木精水溶液染色切片,蒸馏水冲洗后酒精脱水,将切片用伊红染色3min,将切片置于显微镜下观察。

1.8检测胃组织中Fe2+、MDA含量及SOD活性:切取胃黏膜组织并称取重量,将生理盐水按照1∶9的比例加入胃黏膜组织中,用研磨机研磨至组织均浆,离心机3000r/min速度离心,10min后收集上清液,用BCA法对上清液中总蛋白的浓度进行测定。按照试剂盒说明书分别分量上清液中Fe2+浓度、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。

1.9DHE荧光染色法检测胃组织中ROS水平:将胃组织于冰箱中冷冻,取出后切片机切片,将10μmoL/L的HDE加入到切片中,在避光的环境中,37℃孵育30min,洗涤切片后封片。将切片置于显微镜下观察DHE染色的荧光强度,荧光度越高代表ROS含量越高,最后用软件分析各组大鼠胃组织中ROS水平。

1.10蛋白质印迹检测胃黏膜组织中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表达:收集胃黏膜组织,提取组织中总蛋白,DAB法检测蛋白浓度。配置等浓度蛋白溶液为2μg/mL,按照6∶1的比例加入相应的体积的,煮沸溶液10min后保存蛋白溶液于-20℃的冰箱。取蛋白样品30μg,电泳蛋白样品后转移到PVDF膜上,加入5%的脱脂奶粉到PVDF膜上,封闭PVDF膜1h,分别加入一抗Nrf2、Gpx4和SLC7A11(1∶1000),在4℃环境中孵育一抗过夜,后清洗PVDF膜,加入相应的二抗(1∶1000),室温孵育二抗2h。将ECL发光剂加入到细胞中曝光,用显影液显影,用Image Lab软件分析各条带灰度值。

2 结 果

2.1各组大鼠神经功能评分:与NC组相比,SGU组大鼠神经功能评分明显增加(P<0.05);与SGU组相比,三七白及粉L、M、H组大鼠神经功能评分均明显降低,且呈剂量依赖(P<0.05);与三七白及粉H组相比,三七白及粉H+ML385组大鼠神经功能评分明显升高(P<0.05)(图1)。

图1 各组大鼠神经功能评分比较

2.2各组大鼠胃黏膜溃疡指数比较:NC组大鼠胃黏膜光滑,胃皱襞完整,且未见出血及糜烂状,UI为0分;SGU组胃黏膜损伤严重,表面有大量的深色物质堆积,且可见充血水肿,黏膜皱襞可多处出血(点状/线状),甚至有部分的皱襞凹陷,甚至有皱襞中断,UI明显升高;三七白及粉L、M、H组胃黏膜损伤程度明显轻度SGU组,水肿程度逐渐减轻、出血数量逐渐减少,UI明显低于SGU组,且呈剂量依赖(P<0.05);三七白及粉H+ML385组胃黏膜损伤程度和SGU组相似,UI明显高于三七白及粉H组(P<0.05)(图2)。

图2 各组大鼠胃黏膜损伤指数比较

2.3各组大鼠胃组织病理学变化比较:NC组大鼠胃黏膜上皮结构清晰,黏膜腺体均整齐排列,为未见明显的炎性细胞浸润;SGU组大鼠胃黏膜明显损伤,黏膜下可见充血水肿,且有大量的炎性细胞浸润,黏膜上皮细胞大量坏死,深层黏膜被明显破坏;三七白及粉L、M、H组胃黏膜下层水肿充血程度较SGU组明显减轻,炎性浸润较SGU组也明显减少,且呈剂量依赖;三七白及粉H+ML385组胃黏膜损伤程度较三七白及粉H组明显加重,和SGU组相似(图3)。

图3 大鼠胃组织病理学变化(HE染色,×200)

2.4各组大鼠胃组织中Fe2+、MDA含量及SOD活性比较:和NC组相比,SGU组大鼠胃组织中Fe2+、MDA含量升高,SOD活性降低(P<0.05);和SGU组相比,三七白及粉L、M、H组大鼠胃组织中Fe2+、MDA含量降低,SOD活性升高。且呈剂量依赖(P<0.05);和三七白及粉H组相比,三七白及粉H+ML385组胃组织中Fe2+、MDA含量升高,SOD活性降低(P<0.05)(图4)。

图4 各组大鼠胃组织中Fe2+、MDA含量及SOD活性比较

2.5各组大鼠胃组织中ROS水平比较:与NC组相比,SGU组大鼠胃组织中ROS水平明显升高(P<0.05);与SGU组相比,三七白及粉L、M、H组大鼠胃组织中ROS水平均明显降低,且呈浓度依赖(P<0.05);与三七白及粉H组相比,三七白及粉H+ML385组大鼠胃组织中ROS水平明显升高(P>0.05)(图5)。

图5 各组大鼠胃组织中ROS水平比较

2.6各组大鼠胃黏膜组织中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表达比较:和NC组相比,SGU组大鼠胃黏膜组织中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表达明显降低(P<0.05);和SGU组相比,三七白及粉L、M、H组大鼠胃黏膜组织中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表达均明显增加,且呈剂量依赖(P<0.05);三七白及粉H+ML385组大鼠胃黏膜组织中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表达明显低于三七白及粉H组(P<0.05)(图6)。

图6 各组大鼠胃黏膜组织中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表达比较

3 讨 论

脑出血是常见的神经系统病变,其导致的消化道出血是最常见的并发症。脑出血型应激性溃疡在临床上又被称为Cushing溃疡,常以急性的胃黏膜病变、糜烂性胃炎、出血性胃炎、消化道溃疡等症状为主要表现[8]。SGU在临床通常发病隐匿且无明显症状,患者如没有相关溃疡性疾病的病史,患者极易因上消化道出血、胃肠穿孔等因素导致死亡,对危重患者的健康及生命造成严重的威胁[9]。成功的制备动物模型可较好的模拟出人脑出血型SGU相似的病理特征,对脑出血型应激性溃疡的发生发展及预后尤为重要,对研究相对有效的治疗药物有重要意义[10]。本研究通过制备脑出血型应激性胃溃疡模型,结果发现SGU组大鼠神经功能评分和胃溃疡指数均明显增加,且经胃组织大体观察及HE染色证实以上结果,提示模型制备成功。因此,本研究通过对脑出血型应激性溃疡大鼠干预来探究有效的治疗方法。

我国中医中并无应激性溃疡名称,通常称为胃痛和血症。机体中血液生于肝脏,但又藏受在肝中,总统在心脏,输布在肺部,化精在肾脏,脉为血之府。如因郁怒伤到肝脏,肝气会横逆到胃部,热入血分且损伤血络,最后导致吐血。因此在治疗时应遵循“适宜行血但不能止血,适宜补肝但不能伐肝,适宜降气但不能降火”的宗旨,治疗时应从宣畅气机己达郁阳,疏肝畅脾以复升降立法。三七性温、味甘味苦,可入肝经血分,即能功善止血又能化瘀生新,同时具有止血不留瘀且化瘀不伤正的功效。如将三七和白及联合使用可起到收敛止血,治标又治本的功效。本研究采用不同浓度的三七白及粉干预SGU大鼠,结果显示三七白及粉L、M、H组大鼠神经功能评分、胃溃疡指数均明显降低,胃组织溃疡得到明显改善,且随着三七白及粉浓度的增加效果越显著,提示三七白及粉可对脑出血型应激性溃疡大鼠胃黏膜发挥保护作用。

研究发现,胃黏膜组织生物膜脂质中含有大量的不饱和脂肪酸,氧自由基可损伤细胞,通过和脂肪酸发生氧化反应导致胃黏膜屏障内平衡系统功能紊乱[11]。MDA为膜脂质过氧化物分解的产物之一,其能对胃黏膜组织的脂质过氧化程度进行反应,进而被临床用于反应细胞的损伤程度[12]。SOD是存在于生物体内的一种酶类,其能通过清除机体在代谢过程中产生的有害物质,而抑制和防御自由基损伤[13]。SOD活性程度可对机体内清除氧自由基的能力很好的反应,通常被认为是抗氧化能力的指标之一。本研究结果显示,SGU组大鼠胃组织中MDA含量升高、SOD活性降低,三七白及粉L、M、H组MDA含量降低、SOD活性升高,且呈剂量依赖。提示三七白及粉可增强胃黏膜组织的抗氧化能力,进而对胃黏膜组织发挥保护作用。Fagundes等研究证实,胃组织中氧自由基的清除,及胃黏膜组织中的抗氧化能力和应激性溃疡的发生发展密切相关。

铁死亡是指Fe2+和脂质活性氧依赖的非凋亡程序性死亡,其在临床上常以还原性铁激活、含不饱和脂肪酸磷脂过氧化及脂质过氧化修复受损等为主要特征。在脑出血发生后,血液中的红细胞会破裂释放出大量的血红蛋白,并释放出大量的游离铁。这些游离铁可以触发Fenton反应,在细胞内产生大量的活性氧自由基,导致氧化应激和细胞损伤,最终促进应激性胃溃疡的发生。本文通过检测发现,SGU组Fe2+和ROS含量高于NC组,说明有严重的氧化损伤,且Fe2+可作为催化剂调节氧化还原平衡过程,提示铁死亡可能参与脑出血型应激性溃疡的进程。

Nrf2/Gpx4途径是一种细胞内铁代谢调节的重要机制,与铁相关的氧化应激和细胞死亡过程有密切关联。Nrf2是一种转录因子,其可调控Gpx4、SLC7A11等促进细胞内的抗氧化应答,调节细胞内氧化还原平衡。SLC7A11是一种关键的铁死亡调节剂,其能维持氧化还原的稳定状态,进而对铁死亡发挥负调控作用。Gpx4是一种抗氧化酶,它能够降解细胞内的过氧化脂质,减轻氧化应激的损害。脑出血会引起局部炎症反应和氧化应激,导致细胞内铁储存蛋白的释放,进而引发细胞的氧化损伤和细胞死亡。Nrf2/Gpx4途径的激活可以抑制铁的释放和氧化应激反应,从而减轻脑出血后铁相关的细胞死亡。因此猜测,Nrf2/Gpx4途径在脑出血型应激性溃疡中发挥重要的调控作用。本研究结果显示,SGU组胃黏膜组织中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表达明显降低,从而导致细胞内氧化和抗氧化系统失衡,引发细胞死亡。通过三七白及粉干预后Fe2+及ROS含量明显降低,胃黏膜组织中Nrf2、Gpx4和SLC7A11蛋白表达明显增加,提示可能通过激活Nrf2/Gpx4通路抑制铁死亡,缓解氧化损伤,进而对脑出血型应激性溃疡胃黏膜损伤发挥保护作用。为了验证这一猜测,本研究将高剂量的三七白及粉和Nrf2抑制剂ML385联合干预大鼠,结果显示三ML835能减弱三七白及粉对脑出血型SGU大鼠胃黏膜损伤的保护作用,进一步证实三七白及粉可能通过激活Nrf2/Gpx4通路抑制铁死亡的发生。

综上所述,三七白及粉对脑出血型应激性溃疡大鼠胃黏膜损伤发挥保护作用,其机制和激活Nrf2/Gpx4通路抑制铁死亡相关。