SFRP1通过MAPK信号通路对牙髓干细胞活性及血管生成的机制研究

车艺蕾, 方 璘

(航天中心医院口腔科, 北京 100049)

疾病和创伤是导致牙本质或牙槽骨缺损的主要成因之一,其严重影响了患者的生活质量。构建牙本质/骨组织再生治疗系统已成为组织工程和再生医学领域的研究热点。随着时代的不断发展,利用具有强分化潜能的干细胞进行组织修复工程技术已有望应用于修复受损的组织或器官。间充质干细胞(MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞[1],因此,基于间充质干细胞的组织修复疗法已被考虑用于受损组织的修复当中[2]。MSCs可以从多种来源中分离出来,如骨髓、外周血、牙组织和胎盘之中[3]。但与其它来源的间充质干细胞相比,牙组织来源的干细胞具有更为便捷的优势,其被认为是组织工程和再生医学的重要来源之一。牙髓干细胞(DPSC)是一种从牙髓组织中分离,来源于过渡神经坩埚细胞的牙源性间充质干细胞,并已被证明具有分化成骨细胞、成软骨细胞、成神经细胞、成纤维细胞、血管细胞、内皮细胞、周细胞样细胞、平滑肌样细胞和内耳毛细胞的能力[4～6]。在适当的微环境下,牙髓干细胞可作为种子细胞分化成成牙本质细胞,再生牙髓牙本质复合体,有助于牙齿修复、牙根再生,甚至可以通过其利用组织工程方法进行功能性牙齿再生[7]。DPSCs已经显示出与矿化形成相关的特异性表面标记和基质蛋白,其类似于众所周知的骨髓间充质干细胞(BMSCs)。然而,这些干细胞的生长及分化通常依赖于生长因子的参与。分泌性Frizzled相关蛋白-1(SFRP1)被表明在牙齿形成期间发挥了重要作用[8],但其在牙髓干细胞的中鲜有研究,尚不清楚其是否可以调节牙髓干细胞的细胞生物学功能,故而我们以此为研究对象,在牙髓干细胞中探究其是否能发挥调节作用,以期为最终为临床上进行组织学修复等引用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1细胞培养与处理:研究所使用的人源牙髓干细胞(DPSC)购自上海华雅思创科技有限公司,细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中,在37℃和5% CO2条件下培养和进行传代。将对数生长期的DPSC细胞分别接种在6孔板中(2×105/孔)。孵育24h后,使用LiPofectamine 2000(11668-019,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分别将si-NC、si-SFRP1(Shanghai Genechem Co.,Ltd.,Shanghai,China)(si-RNA 50 nM)分别转染到细胞中,操作按照说明书进行。转染48h后进行后续实验。

1.2Quantitative Real-time PCR检测SFRP1 mRNA水平:按照说明书,使用Trizol试剂(Invitrogen)从培养的细胞中分离出总RNA。用PrimerScript RT Master Mix(Takara,Dalian,China)将1 μg RNA反转录为cDNA。然后根据说明书用SYBR Premix Ex Taq(Takara,Dalian,China)在 ABI 7500(ABI,American)上进行qRT-PCR实验,GAPDH作为内参,通过2-△△Ct法分别计算基因的相对表达量。PCR引物见表1。

表1 引物序列

1.3Westernbolt检测蛋白表达水平:提取各样品蛋白,按BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific Pierce)说明书测定蛋白质浓度,将提取的蛋白加入上样缓冲液后再95℃煮10min,每个蛋白样本分别取30 μg经聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE,10%(w/v))电泳,电泳电压80v转120v,湿转,转膜电压100mv,时间45～70min,PVDF转膜,5% BSA室温封闭1h,4℃与一抗孵育过夜。TBST漂洗3次,辣根过氧化物酶结合的二抗IgG,常温孵育1h,TBST充分洗涤后以ECL法显色,Bio-OAdGelEZ成像仪(Bio-OAd,California,USA)显影。目的条带采用Image J软件(National Institutes of Health,Bethesda,Maryland,USA)进行灰度值分析。一抗:SFRP1(1∶1000,ab126613,Abcam,UK)、p-p38(1∶1000,ab178867,Abcam,UK)、p38(1∶1000,ab170099,Abcam,UK)、actin(1∶1000,ab8227,Abcam,UK)、GAPDH(1∶1000,ab9485,Abcam,UK);二抗:羊抗兔IgG(1∶5000,ab6721,Abcam,UK)

1.4CCK-8检测细胞增殖活力:将细胞接种到96孔板中(每孔3×103个细胞)并在37℃下培养。分别培养0h、24h、48h和72h后,向每个孔中加入10μLCCK-8反应试剂(Beyotime Institute of Biotechnology,Haimen,China)。37℃孵育4h后,检测450 nm处的吸光度,绘制细胞增殖曲线。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡:调整细胞浓度为2×105细胞/孔,接种至6孔板中,24h后根据后续实验需求进行处理。调整细胞浓度为5×105细胞/mL,加入5μL Annexin V-APC and 5μL 7-AAD,在室温避光孵育15min,用流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)检测细胞凋亡。实验重复3次。

1.6细胞划痕实验检测细胞迁移:将细胞以5×105个/孔接种于6孔板中,培养至达到融合。如上述处理方法处理细胞后,使用1000L无菌微量移液器吸头在每孔的细胞层中心下方划痕。然后用PBS清洗细胞两次,并在不含胎牛血清的培养基中培养。在划痕后0、24h于明视场显微镜(Olympus,Japan)下每组采集3个随机独立视野图像。使用ImageJ软件(v1.52a;National Institutes of Health)对划痕的宽度进行定量测量,并计算迁移率。

1.7血管形成实验检测血管形成能力:向24孔板中加入100L液化Matrigel(Becton,Dickinson and Company),将平板置于37℃下,直至Matrigel凝固。然后,将上述细胞接种于24孔板中。8h后,使用明视场显微镜观察DPSC的管状形成。使用ImageJ软件(v1.52a; National Institutes of Health)对血管的分支数及长度进行量化。

2 结 果

2.1敲低SFRP1表达水平抑制牙髓干细胞增殖活性:为了探究SFRP1对牙髓干细胞活性的影响,我们首先通过si-SFRP1敲低牙髓干细胞的表达,qRT-PCR与Westernblot检测si-SFRP1的敲降效率,我们成功敲降了牙髓干细胞中SFRP1的表达(图1A、B,均P<0.01)。接下来,采用CCK-8与流式细胞术检测细胞的增殖活力与凋亡情况,我们观察到si-SFRP1组较si-NC组细胞增殖活力显著下降,凋亡则显著增加(图1C、D,均P<0.01)。以上结果说明,敲低SFRP1表达水平可以抑制牙髓干细胞的增殖活性。

图1 敲低SFRP1抑制牙髓干细胞的活性

2.2敲低SFRP1抑制牙髓干细胞的血管形成能力:为了进一步探究SFRP1对牙髓干细胞的细胞功能学影响,我们对各组细胞进行了细胞划痕能力检测以及血管形成能力检测,我们观察到si-SFRP1组较si-NC组DPSC细胞迁移能力显著下降,同时形成的管状结构分支点数目也显著减少(图2A、B,均P<0.01)。以上结果说明,敲低SFRP1可以损害牙髓干细胞的迁移及血管形成能力。

图2 敲低SFRP1抑制牙髓干细胞的血管形成能力

2.3敲低SFRP1通过MAPK信号通路抑制牙髓干细胞:我们推测,敲低SFRP1对牙髓干细胞的影响是通过MAPK信号通路作用的。为了验证这一猜想,我们通过Westernblot检测了各组细胞的MAPK信号通路关键蛋白p-p38与p38,观察到si-SFRP1组较si-NC组p38的磷酸化显著减少(图3,P<0.01)。综上所述,表明敲低SFRP1通过失活MAPK信号通路抑制牙髓干细胞的活性及血管生成能力。

图3 MAPK信号通路活性

3 讨 论

骨缺损及其相关疾病不会直接影响人类的生存,但会严重影响人类的生活质量,降低生活的幸福感。迄今为止,骨再生仍然是医学中的一个重要挑战,尤其是在整形外科和口腔颌面外科中。近年来,受益于仿生学,用于骨组织再生的新型材料和支架已经被开发出来。骨组织工程涉及多个步骤,例如,将具有骨诱导分子的细胞掺入支架并在体外进行预培养,然后将负载细胞的支架植入骨缺损区域。在这些步骤中,选择合适的细胞和骨诱导分子至关重要,间充质干细胞被认为是用于组织修复的较好来源。据报道,负载DPSC的支架能够促使骨再生,由此可见探究DPSC的分子调控机制的重要性。

SFRP1在细胞凋亡调节中发挥显著作用,本研究通过si-SFRP1敲低牙髓干细胞的表达,敲低SFRP1后,牙髓干细胞凋亡率上升。SFRP1的删除或沉默涉及表观遗传和其他机制,并参与生物行为,如细胞增殖、迁移等,本研究同样观察到了这一点。MAPK是一种Ser/Thr蛋白激酶,存在于大多数细胞中,并负责将细胞外信号分子转导到细胞核中。在细胞增殖、分化和其他活动中起重要的调节作用。MAPK主要包括ERK、p38和C-JNK信号通路。MAPK家族中的经典通路,p38 MAPK信号通路参与各种应激反应和炎症因子的信号转导。p38 MAPK已经成为炎症和癌症预防和治疗的重要潜在靶点。在前牙本质向次级牙本质的发育过程中,p38 MAPK通路的调节对成牙本质细胞的分泌活动至关重要。还有报道表明在抑制p38 MAPK信号通路后,碱性磷酸酶和OCN的表达显著减少。

本研究首次观察到SFRP1敲低后可以影响MAPK信号通路中p38的磷酸化,同时影响牙髓干细胞的增殖活力、凋亡、迁移与血管形成能力。证明了SFRP1与MAPK在牙髓干细胞中具有分子调控机制。但本研究仅从p38 MAPK通路入手,并未探究ERK1/2是否也发挥了调控作用,同时并未进一步探究SFRP1是否具有调节牙髓干细胞分化的能力,在未来,我们将进一步对这些方面进行探究,以期在临床上为组织器官修复和移植提供完整的理论依据。