不同储存条件鱼粉对凡纳滨对虾生长性能和抗氧化能力的影响

■ 林 毅 邓应凯 王铵静 杨奇慧* 谭北平 迟淑艳 陈宇航 陈嘉声

（1.广东海洋大学，水产动物营养与饲料实验室，广东湛江 524025；2.广东德宁水产科技有限公司，广东佛山 528399；3.广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室，广东湛江 524088）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）具有繁殖速度快速、抗逆性强、繁殖期长、食性杂、对蛋白养分要求较低等优势，且含肉量高、口感好，是目前全球水产饲养产量最多的三大优质种类之一[1-2]。从1988年我国引进凡纳滨对虾至今，凡纳滨对虾已经成为了中国饲养量最高、分布范围最广的养殖对虾种类。中国2020年海水饲养虾类总量为145.02万吨，其中凡纳滨对虾海水饲养总量为111.75万吨，占我国虾类海水饲养总量的81%以上，具有极高经济价值[3-4]。

鱼粉因其必需氨基酸平衡，适口性极佳，蛋白质占比高，水产动物能够轻易摄取消化等优点，成为水产饲料中不可缺少的蛋白质来源[5]。鱼粉质量是影响水产饲料品质重要因素之一。对花鲈（Lateolabrax japonicus）[6]和大西洋鳕（Gadus morhua）[7]等研究表明，优质鱼粉比劣质鱼粉对水产动物促生长效果更好。然而，引起鱼粉变质因素很多，如鱼粉储藏条件、加工条件、运输时间等因素，这些因素都会导致鱼粉中蛋白质腐败，脂肪氧化，最终造成鱼粉品质下降[8]。其中，又以储藏条件对鱼粉品质影响尤为重要，特别是储藏温度与储藏时间[9]。研究表明，高温条件下（37 ℃）或鱼粉贮藏时间过长均会加重鱼粉变质[10-11]。因此，为确保养殖动物饲料中的鱼粉质量，进行鱼粉贮藏条件对水产动物生长和饲料利用影响的研究具有重要意义。

目前，国内外关于不同储存条件下鱼粉对水产养殖动物的研究较多。低温处理后鱼粉能够提高鱼的生长和饲料利用率，如金头鲷（Sparus aurata）[12]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[13]、大西洋比目鱼（Hippoglossus hippoglossus）[14]和斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）幼鱼[11]等。此外，水分含量低的鱼粉能够提高鱼类生长和饲料利用率，如花鲈[6]和大西洋鳕[7]。上述研究表明，高品质鱼粉对养殖动物生长和饲料利用均有显著积极作用。在凡纳滨对虾研究中，程传龙[15]通过对不同储存时间鱼粉进行试验，结果表明储存时间越长，对虾的生长性能和饲料利用率均显著下降。但关于不同温度储存下鱼粉对凡纳滨对虾影响的相关研究还鲜有报道。因此，本试验旨在通过评估4 ℃和室温下分别贮存45、90 d 及135 d 鱼粉对凡纳滨对虾生长性能和抗氧化能力的影响，为凡纳滨对虾饲料中鱼粉科学、合理和高效利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲料配制

鱼粉为同一批次，鱼粉新鲜度使用挥发性盐基氮（VBN）、硫代巴比妥酸值（TBA）、组胺（HA）及酸价（AV）指标来综合评判；鱼粉放置-4 ℃冰箱和空调室内（实测温度20.5～22.5 ℃）储存，新鲜鱼粉放置于-20 ℃并于同一时间制粒。

饲料中蛋白质源是以白鱼粉等为主，脂肪源是以鱼油等为主，根据储存温度与储存时间的不同，配制成7 种等氮等脂试验饲料分别为FFM（对照组，-20 ℃储存的新鲜鱼粉）、4-FM45（4 ℃储存45 d）、4-FM90（4 ℃储存90 d）、4-FM135（4 ℃储存135 d）、RT-FM45（室温储存45 d）、RT-FM90（室温储存90 d）及RTFM135（室温储存135 d），试验饲料组成及营养水平见表1，鱼粉新鲜度指标见表2。饲料制作参考梁达智等[16]和Lin 等[17]方法。饲料原料经粉碎后通过80 目筛，按照饲料配方进行称重，原料根据重量由小到大逐步添加，并置于V型立式搅拌机（浙江正泰电器股份有限公司，JS-14S型）充分搅拌均匀。充分混合后加入大豆卵磷脂和鱼油及适当（30%～40%）水，混合匀称后，再采用双螺杆挤条机（华南理工大学，F-75型）制作成1.0 mm和1.5 mm的颗粒饲料，干燥至10%的饲料含水量后，将其存进密闭袋子，放在-20 ℃的冰箱中保存。

表1 试验饲料组成与营养水平（风干基础，%）

表2 不同储存条件对鱼粉品质的影响

1.2 试验动物与饲料管理

从湛江市雷州兴海虾苗厂购买试验虾苗，在湛江东海岛海洋高新科技园进行养殖试验。虾苗在室外水泥池中暂养。对虾苗禁食24 h后分组，按照试验设计选取840尾虾体健康、大小均匀、平均质量为（0.40±0.02）g 的幼虾，随机分配在0.35 m3的聚乙烯玻璃纤维钢试验桶中，每个试验桶放入40 尾对虾，向每桶试验虾依次投喂相对应的7 组试验饲料，每天投喂4 次（07：00、11：00、17：00 和21：00），饲料投喂量为对凡纳滨对虾总重的8%～10%，在喂食后1 h 内，根据不同的剩料情况，对饲料的摄入量进行相应的调节。饲养期的头4 周隔日换水，后4 周每日换水1 次，每次换水量为30%～50%。持续曝气，定期检测水质，试验期间水体温度为27～32 ℃，溶氧量不低于7 mg/L，盐度为26～29，氨氮量不高于0.03 mg/L，养殖期8周。

1.3 样品采集

样品采集参照何树青等[18]方法。经过8周的养殖试验后，对试验虾进行24 h饥饿处理，然后对每个试验桶里的凡纳滨对虾进行称量并计数，以计算生长指数。从每个试验桶里随机选择5尾全虾，先吸干其体表水分后，再放入密封袋内，放入-20 ℃冰箱中储存备用，用于待测虾体成分。在每个试验桶里再随机选择5 尾虾放在冰面，剥开其肝胰腺后将其装入冷冻存管，以液态氮保存，然后再放进-80 ℃冰箱，待测酶活性。最后，每桶再随机选取3 尾对虾将剥出其肝胰腺，立即置于装有0.7 mL RNA-later离心管（1.5 mL）中，置于-80 ℃冰箱冻存。

1.4 分析测定方法

1.4.1 饲料及体成分分析

根据美国食品化学协会（AOAC）[19]对饲料及体组分进行了测定。在105 ℃的烤炉中进行水分测量；采用凯氏定氮方法测定粗蛋白的含量（KjeltecTM8400，Sweden）；采用索氏抽提取方法测定粗脂肪的含量（以石油醚为提取液）；采用550 ℃的箱式电阻炉进行粗灰分的测定。

肝胰腺中胰蛋白酶活性（TRS）、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性等抗氧化指标检测根据试剂盒说明书执行操作。另外，对肝胰腺谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性的测定参照张海涛等[20]方法。

1.4.2 消化酶的测定

所有的消化酶测定均根据试剂盒说明书执行操作。

1.4.3 肝胰腺CAT、GSH-Px和TRS基因的表达量检测

肝胰腺CAT、GSH-Px和TRS基因表达量参照Gowda 等[21]方法。引物根据Gene Bank 检索管家基因和目的基因序列设计，由上海英潍捷基贸易有限公司合成（表3）。引物按 Gene Bank 检索，用上海英潍捷基商贸有限公司SYBR®Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒（大连）进行荧光定量反应。

表3 管家基因和目的基因的引物序列

1.4.4 生长指标计算公式

存活率（SR，%）=（Nt/N0）×100

增重率（WGR，%）=（Wt-W0）/W0×100

特定生长率（SGR，%/d）=（lnWt-lnW0）/t×100

饲料系数（FCR）=Wf/（Wt-W0）

蛋白质效率（PER，%）=（Wt/Pi）×100

式中：Nt——终末虾尾数；

N0——初始虾尾数；

Wt——终末体重均值（g）；

W0——初始体重均值（g）；t——试验天数（d）；

Wf--摄食饲料干物质总重（g）；

Pi——蛋白质摄入量（g）。

1.5 数据统计分析

试验结果用“平均值±标准差（mean+SD）”来表示。试验数据结果采用SPSS17.0 统计软件进行单因素分析（one-way ANOVA)，采用Duncan’s法进行多重比较，以表明试验组之间有无显著性，P＜0.05 为有显著差异。

2 结果与分析

2.1 不同储存条件鱼粉对凡纳滨对虾生长性能和饲料利用的影响

由表4可知，在4 ℃条件下，随着鱼粉储存时间增加，WGR、SGR、PER 先上升后下降；4-FM45 组WGR最高，显著高于其他各组（P＜0.05）；4-FM45组SGR 最高，显著高于其他各组（P＜0.05）；4-FM45 组PER 最高，显著高于4-FM90及4-FM135组（P＜0.05）；FCR先下降后上升，4-FM45 组FCR 显著低于其他各组（P＜0.05）。在室温条件下，随着鱼粉储存时间增加，WGR 先上升后下降，RT-FM45 组显著高于其他各组（P＜0.05）；SGR 和PER 先上升后下降，RT-FM45 组SGR 和PER 最高，且均显著高于RT-FM135 组（P＜0.05）。FCR 先下降后上升，RT-FM45 组FCR 最低，显著低于RT-FM135 组（P＜0.05），与其他组无显著差异（P＞0.05）。不同储存条件下鱼粉对SR 无显著影响（P＞0.05）。

表4 不同储存条件鱼粉对凡纳滨对虾生长性能和饲料利用的影响（n=3）

2.2 不同储存条件鱼粉对凡纳滨对虾体成分的影响

由表5可知，在4 ℃条件下，随着鱼粉储存时间增加，凡纳滨对虾体内粗蛋白含量增加，4-FM135 组粗蛋白含量达到了最大值，显著高于4-FM45 组（P＜0.05）。粗脂肪含量先提高后逐渐降低，4-FM135 组粗脂肪含量达到最低值，显著低于其他所有组别（P＜0.05）。4-FM90 组粗灰分含量显著低于其他所有组别（P＜0.05）。在室温下，随着鱼粉储藏时间的延长，凡纳滨对虾体内粗脂肪含量先提高后逐渐下降，RTFM45 组粗脂肪含量达到最高值，显著高于其他各组（P＜0.05)。粗灰分含量先降低后提高，RT-FM45 组粗灰分含量显著低于其他所有组别（P＜0.05)。不同储存条件下鱼粉对凡纳滨对虾体内水分含量无显著影响（P＞0.05）。

表5 不同储存条件鱼粉对凡纳滨对虾体成分的影响（干物质基础，%）

2.3 不同储存条件鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化能力的影响

由表6可知，在4 ℃条件下，随着鱼粉贮存时间增长，T-AOC 以及CAT、GSH-Px 活性先提高后降低，且均在4-FM45 组达到了最大值，显著高过其他所有组别（P＜0.05）。SOD活性先降低后逐渐提高，4-FM90组显著低于其他组别（P＜0.05）。TRS 活性先降低后提高，在4-FM45 组达到最低值，显著低于其他组别（P＜0.05）。在常温条件下，随着贮存时间增长，T-AOC 和CAT活性先提高后逐渐降低，T-AOC在RT-FM45组达到最大值，显著高过其他所有组别（P＜0.05）。SOD、GSH-Px活性随着时间增加而逐渐降低，SOD活性FFM组显著高于其他组别（P＜0.05）。TRS活性先降低再增高，RT-FM90组TRS活性显著高于其他组别（P＜0.05）。

表6 不同储存条件鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化能力的影响

2.4 不同储存条件鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺中CAT、GSH-Px和TRS mRNA表达量的影响

由表9 可得，鱼粉贮藏时间及贮藏温度对凡纳滨对虾肝胰腺中CAT、GSH-Px及TRSmRNA 表达量均有显著影响（P＜0.05），且鱼粉储存时间与储存温度间交互作用对凡纳滨对虾肝胰腺中CAT、GSH-Px及TRS mRNA 表达量产生显著影响（P＜0.05）。由图1～图3 可得，在4 ℃条件下，随着鱼粉储存时间增加，CAT、GSH-Px及TRSmRNA 表达量先上升后下降，都在4-FM45 组达到最高值，显著高过其他所有组别（P＜0.05）。在室温条件下，随着鱼粉储存时间增加，CAT基因表达量逐渐下降再升高，FFM组显著高过其他所有组别（P＜0.05）。GSH-PxmRNA 表达量先下降后上升，RT-FM135组显著高过其他所有组别（P＜0.05）。TRSmRNA 表达量先上升后下降，在RT-FM45 组TRSmRNA表达量显著高于其他各组（P＜0.05）。

图1 不同储存条件鱼粉凡纳滨对虾肝胰腺中CAT mRNA表达量的影响（n=3）

图2 不同储存条件鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺中GSH-Px mRNA表达量的影响

图3 不同储存条件鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺中TRS mRNA表达量的影响

3 讨论

3.1 不同储存条件下鱼粉对凡纳滨对虾生长及饲料利用的影响

鱼粉品质能够直接影响水产动物的饲料利用效率和生长性能, 虾类和水产肉食性鱼类受其影响极其显著[22]。对凡纳滨对虾[15]研究表明，鱼粉在常温露空时间越长，对虾的增重率、饲料利用率及蛋白沉积率均显著下降；此外，大西洋比目鱼[14]和金头鲷[12]研究结果同样表明，随着鱼粉储存时间增加，鱼粉品质下降导致水产动物增重率、特定生长率及饲料利用率均显著下降。在本试验条件的研究结果与上述结论相似，说明随着储存时间增加，鱼粉其本身营养物质的被降解和其品质下降，形成一些对饲养动物有害成分，继而造成饲养动物生长性能下降。在本试验条件下，随着鱼粉储存时间增加，低温储存鱼粉组对虾的增重率下降程度较慢。研究表明，高温下会加速鱼粉氧化速度，而降低温度可预防鱼粉发霉变质[23]。低温组对虾增重率下降缓慢，原因可能是低温能够有效抑制鱼粉发生化学变化和微生物生长繁殖，防止鱼粉品质腐败[24]。

3.2 不同储存方法下鱼粉对凡纳滨对虾体成分的影响

鱼粉质量直接影响水产动物的营养成分，鱼粉中的蛋白质品质、氨基酸组成都是影响水产动物体成分的关键因素，水产动物体成分也间接体现出鱼粉质量的优劣情况[25]。对凡纳滨对虾[15]研究表明，随着鱼粉储存时间增加，能够显著提升全虾粗蛋白和粗灰分含量，显著减少全虾粗脂肪含量；此外，在大西洋鳕[7]研究结果同样表明，低质量鱼粉会显著提高鱼体灰分含量。本试验条件下的研究与上述结论相似，说明随着鱼粉储存时间增加，鱼粉会产生一些对养殖动物有害物质，从而导致养殖动物体成分中脂肪显著降低，灰分显著升高[15]。

3.3 不同储存方法下鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化能力的影响

动物机体中自由基的形成数量过多时，会与多不饱和脂肪酸进行反应，产生脂质过氧化物，引起氧化破坏，从而干扰机体的新陈代谢和生命活动[26]。肝胰腺中各种抗氧化酶和抗氧化分子的总抗氧化能力是由肝胰腺T-AOC 代表，其反映了机体抗氧化系统功能状况的综合性指数[27-29]。鱼粉不同新鲜度对黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）幼鱼肝脏T-AOC 活性无显著影响[30]，与大口黑鲈（Micropterus salmoides）[31]研究结论相一致。然而，本试验结果表明，在两种储存温度条件下，随着储存时间的增加，对虾肝胰腺T-AOC活性降低。这可能是由于所饲喂鱼粉来源不同导致结果不同[30]。此外，研究表明，鱼粉储存过程中生成氧化物质能够影响机体的抗氧化机能活动，从而显著降低T-AOC活性[15]。

SOD 是人体中一种非常重要的抗氧化酶，它能快速地将游离基歧化为分子氧和过氧化氢，使其在一定的水平上维持其活性[32-34]。对凡纳滨对虾[15]研究发现，随着鱼粉储存时间增加，肝胰腺SOD 活性呈现降低趋势，与斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）的结论相一致[35]。在本试验中，两种储存温度条件下，SOD 活性均得到相似的结论。因此，鱼粉随着贮存时间增加会降低凡纳滨对虾肝胰腺SOD活性。

CAT 是机体内的一个特别重要抗氧化酶，可以将具有高氧化活性的过氧化氢快速的分化为水和氧气，进而维护机体避免遭到氧化破坏，在机体的抗氧化防护体系中具有非常深远意义[36]。低温条件下，随着鱼粉储存时间增加，金头鲷[12]肝脏中CAT 活性显著降低；对黄颡鱼[30]研究也有相类似发现，其肝脏中CAT活性随着鱼粉新鲜度降低显著降低。本试验条件的研究与上述结论一致。此外，凡纳滨对虾肝胰腺中CATmRNA 表达量与CAT 活性相一致。这表明储存时间较短且新鲜度较好的鱼粉能够提高凡纳滨对虾肝胰腺CAT活性。

还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）是一种重要的抗氧化剂，GSH 能被GSH-Px 催化生成氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione, GSSG），使有毒过氧化物还原成一种无毒的羟基化合物，从而保持细胞膜组织及其功能免遭过氧化物的损害[37]。通过对黄颡鱼幼鱼的研究发现，随着鱼粉新鲜程度的下降，肝脏中GSH-Px活性显著降低[30]。本试验条件下的研究与上述结论一致。检测到凡纳滨对虾肝胰腺中GSH-PxmRNA表达量与GSH-Px 活性一致，这表明低质量鱼粉会抑制凡纳滨对虾肝胰腺GSH-Px活性。

3.4 不同储存条件下鱼粉对凡纳滨对虾TRS 活性及TRS mRNA表达量的影响

消化酶活性是表现动物对所摄食饲料消化吸收能力的主要指标，其优劣也决定着动物对饲料中营养物质消化吸收能力高低。消化酶活性的改变，能够表现出机体在各种营养情况下的生理反应[38]。TRS是凡纳滨对虾中的一种主要消化酶，具有消化蛋白质的作用，在机体消化和吸收过程中扮演不可取代的角色[39-40]。对凡纳滨对虾[15]研究中发现，TRS 活性及TRSmRNA表达水平均随鱼粉品质的下降呈现降低趋势，与本试验结果一致。这表明低质量鱼粉会降低营养物质对胰腺细胞的刺激，从而降低了TRS 活性及TRSmRNA表达量。

4 结论

本试验结果表明，在4 ℃和常温下储存135 d 的鱼粉显著降低凡纳滨对虾生长性能和饲料利用率；4 ℃条件下储存的鱼粉品质要优于常温条件储存的鱼粉。此外，饲喂低质量鱼粉显著降低凡纳滨对虾的抗氧化能力。