基于网络药理学研究复方精油治疗颈肩痛的关键活性成分及透皮吸收性能

邱晓雨，金浩鑫，吴东，黄文平，曾文辉，龚建平,

1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330006；3.江西省药品检查员中心，江西 南昌 330029

颈肩痛是指颈、肩、肩胛等处的疼痛，伴有一侧或两侧上肢痛、颈脊髓损害症状等，主要源于颈椎病、肩周炎等疾病［1］。颈肩痛的治疗方式包括手术治疗和非手术治疗［2］。大多数患者选择非手术治疗，主要分为药物治疗、推拿手法治疗、针灸治疗、牵引治疗等［3-6］。目前暂无针对颈肩痛的特效药，临床上主要应用消炎镇痛药物如阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸等，此类药物可有效镇痛，但长期服用对胃肠道、心血管、神经系统、肝脏、肾脏等有不良反应［7］，且随着疼痛加重服药剂量也随之增加。

芳香疗法是一种替代疗法，主要使用精油通过推拿按摩的方式进行治疗，可缓解疲劳、疼痛等症状［8］。中药精油的止痛作用近年来颇受关注，并展现出多种治疗疼痛效果，如痛经、偏头痛、颈椎痛等［9］，而精油多来源于具有活血化瘀、通经止痛等功效的中药。精油治疗颈肩痛多选用经皮给药的给药方式［10］。研究发现两种或者多种不同中药精油组合得到的复合中药精油递释系统相较于单一中药精油的生物活性可显著增强［11］。

本实验研究选取包括艾叶、没药、乳香、肉桂、干姜及冬青六种精油组成复方精油，文献［12-14］报道上述六种精油主要含有成分为1,8-桉叶素（桉油精）、α-姜黄烯、蒎烯、D-莰烯、芳樟醇、肉桂醛等。而研究［15］表明颈肩痛的发病机制与外周敏化和中枢敏化有关，钾离子、钠离子、5-羟色胺、ATP 等炎性介质激活花生四烯酸通路引发痛敏反应，此外颈肩痛和神经源性炎症也有关系［16］。“网络药理学”是一门运用网络方法分析药物与疾病和靶点之间“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系的药理分析手段［17］。因此，本研究将以网络药理学探究对颈肩痛的作用成分及靶点，并结合气相色谱-质谱（GC-MS）技术鉴定复方精油的化学成分，最后选取指标成分以Franz 扩散池法考察透皮吸收性能。以期探究复方精油治疗颈肩痛的主要靶点和通路，为深入研究精油经皮给药提供参考。

1 材料

1.1 动物

KM 小鼠，18～22 g，雌雄各半，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2022-0004。

1.2 药材与试剂

艾叶（批号20211106）、乳香（批号20210405）、没药（批号20210504）、肉桂（批号20211009）、干姜（批号20211211）、冬青（批号20210608）药材均购于江西一方药业有限公司。乙酸乙酯（中国医药集团有限公司）；无水硫酸钠（上海罗恩试剂有限公司）；甲醇（中国医药集团有限公司）。

对照品：桉油精对照品（批号110788-201506,含量98.4%），樟脑对照品（批号110747-201409,含量98.7%）购买于中国食品药品研究院。龙脑对照品（批号DST210312-194,含量98.0%）购买于成都乐美天医药科技有限公司。

1.3 仪器

Agilent 7890B-7000D 三重四级杆气相质谱仪，KDM 型控温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器），Agilent 6890N 气相色谱仪，TG328A 十万分之一天平（北京赛多利斯仪器），TP-6 型智能透皮扩散仪及垂直式 Franz 型扩散池（天津精拓仪器科技），HC-3016R 高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器）。

2 方法与结果

2.1 挥发油的提取

参照2020 年版《中国药典》通则2204 挥发油测定法提取，以得油量为指标单因素考察料液比、浸泡时间、蒸馏时间对提取量的影响，得到最佳提取工艺参数，见表1。

表1 药材最佳提取工艺参数

2.2 复方精油的GC-MS 分析

2.2.1 色谱条件 气相条件：分流模式，分流比为2∶1；载气流速，1.0 mL/min；色谱柱，Agilent VF-WAXms 30 m×250 µL×0.5 µm；程序升温，初始温度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升温至180 ℃，再以5 ℃/min 升温至250 ℃，保持5 min；传输线温度为260 ℃；进样量为1 μL；载气为氦气。

质谱条件：Scan 全扫描模式；溶剂延迟：3.5 min；离子源温度：230 ℃；电子能量：70 eV；扫描范围：15～650 m/z。

2.2.2 GC-MS 分析 GC-MS 测定复方精油中的化学成分，总离子流见图1。结合文献资料解析，鉴定出化学成分75 个，占比最高的是桉油精、反式肉桂醛、丁香酚、芳樟醇、α-姜黄烯、莪术烯、樟脑、蒈烯、莰烯等。

图1 复方精油的GC-MS总离子流图

2.3 网络药理学探讨

2.3.1 精油成分及颈肩痛靶点筛选 基于GC-MS定性成分和已发表的文献报道，并通过TCMSP 数据库、HERB 数据库补充收集复方精油成分。基于精油的经皮给药特点和里宾斯基五规则，ALogP是反映生物膜之间通透性的主要物理化学参数之一［18］，以1＜ALog P＜5 为指标，筛选精油的目标活性靶点。

以“Cervical Syndrome 颈椎综合征”“Myalgia 肌痛”“Neck Pain 颈部疼痛”“Pain Syndrome Myofascial疼痛综合征肌筋”“Shoulder Pain 肩部疼痛”为颈肩痛相关的疾病关键词，通过挖掘GeneCards 数据库、OMIM 数据库、Drugbank 数据库、DisGeNET 数据库获取颈肩痛的疾病靶点。

结果显示筛选后活性成分共77 种，导入Uniprot蛋白质数据库合并删除重复值后共183 个化合物靶点和1 126 个疾病靶点。

2.3.2 中药精油-成分-靶点网络的构建 将药物疾病交集靶点及成分输入Cytoscape3.9.1 软件得到网络图，见图2。

图2 中药-活性成分-靶点网络

2.3.3 中药精油成分-颈肩痛疾病靶点PPI 网络构建将成分靶点与疾病靶点做Veen 图汇集得到共同靶点46 个，见图3。导入STRING 数据库，将生物种类设定为“Homo sapiens”，得到核心靶点，见图4。

图3 活性成分和疾病靶点的Venn图

图4 核心靶点

2.3.4 中药精油-颈肩痛疾病靶点功能与通路的富集分析 在Metascape 的基因面板中导入关键靶点，物种限定设置为“Homo sapiens”，进行GO 富集分析和KEGG 信号通路富集分析。分析时设置P＜0.01，重叠值（Overlap）≥3，富集值（Enrichment）≥1.5。

分析获得974 个GO 功能条目，选取排名前10的条目绘制GO 功能分析图，见图5。在生物过程（biological process，BP）中，涉及对异种刺激的反应，循环系统过程、血液循环、细胞对氮化合物的反应，对细胞外刺激的反应等；在细胞组分（cellular component，CC）中，涉及膜筏、膜微区、质膜筏、小窝突触膜等；在分子功能（molecular function，MF）中，涉及G 蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素受体活性、金属离子跨膜转运蛋白活性、α1-肾上腺素能受体活性等。KEGG 通路富集分析得到化学致癌-受体激活、脂质和动脉粥样硬化、5-羟色胺能突触、神经活性配体-受体相互作用、cGMPPKG 信号通路、IL-17 信号通路、TRP 通道的炎症介质调节、胆碱能突触、花生四烯酸代谢、细胞色素P450 对异生素的代谢、cAMP 信号通路类风湿关节炎等相关信号通路，见图6。

图5 潜在靶点的GO富集分析

图6 潜在靶点的KEGG通路富集分析

2.4 复方精油GC 含量测定

2.4.1 气相色谱条件 采用HP-5（0.32 mm×30 m×0.25 μm）毛细管色谱柱，以氮气为载气，程序升温，初始温度为90 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 上升到110 ℃；再以10 ℃/min 上升到150 ℃，保持10 min。检测器温度为250 ℃，进样口温度200 ℃，进样量1 µL，分流比为5∶1。

2.4.2 方法学考察 专属性考察：取空白溶剂、供试品透皮接收液和含桉油精157.792 µg/mL、樟脑479.68 µg/mL、龙脑468.48 µg/mL 的混合对照品溶液，按“2.4.1”色谱条件进样检测。结果如图7 所示，空白溶剂没有干扰测定。

图7 色谱图：A.空白溶剂，B.混合对照品溶液，C.供试品透皮接收液

线性考察：精密量取混合对照品溶液，加乙酸乙酯稀释为系列质量浓度的溶液，分别按“2.4.1”项下色谱条件进样分析。以质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归。结果表明，桉油精、樟脑、龙脑在表2 所示的质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表2 线性关系考察结果

精密度考察：取含樟脑479.68 μg/mL、龙脑468.48 μg/mL、桉油精157.792 μg/mL 的混合对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件，平行进样6 次，结果表明，桉油精、樟脑、龙脑峰面积的RSD 分别为1.20%、0.53%和0.87%，表明仪器精密度良好。

稳定性考察：取同一接收液样品，按“2.4.1”色谱条件下分别于0、2、4、8、12、24 h 时进样分析，结果显示，桉油精、樟脑、龙脑的峰面积RSD分别为3.84%、1.78%、3.47%，表明样品在24 h 内稳定。

2.5 体外透皮吸收考察

2.5.1 小鼠离体皮肤的制备 用脱毛膏除掉小鼠腹部体毛，小鼠处死后立即剪下腹部皮肤，将皮肤附带的脂肪和皮下组织清理干净，用生理盐水小心清洗并擦干多余水分，再用锡箔纸包裹后放置-20 ℃冷冻保存，备用。

2.5.2 Franz 扩散池试验 将转子置于接收池中，量取15 mL 空白接收液（无水乙醇和生理盐水以3∶7的比例混合，超声10 min 即得）加入。将冷冻保存的小鼠离体皮肤放入生理盐水中浸泡30 min，取出后用滤纸吸干水分，剪成适当大小，真皮层朝向接受池平铺，夹紧固定且排尽气泡。精密吸取1 mL复方精油样品，置于鼠皮上并用封口膜将释放池封闭，平行六组。

智能透皮试验仪循环水浴温度37.5 ℃，搅拌速度为300 r/min，预平衡30 min。在计时开始后的第1、2、4、6、8、10、12、24 h 精密吸取接收液1 mL，并补充1 mL 空白接收液。将所取的接收液4 ℃低温离心20 min 后加入1 mL 乙酸乙酯萃取，静置取上清液用0.22 µm 有机滤膜滤过，置于进样小瓶中，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，并计算指标成分桉油精、樟脑和龙脑的累积透过量Qn（µg/cm2）。计算公式为：

其中：Qn 为第n 个时间点单位面积的累积透过量（µg/cm2），Cn、Ci 分别为第n、i 个时间点测得的药物质量浓度（µg/mL），V 为接收液加入体积（15 mL），Vi 为每次取样体积（1 mL），A 为有效透皮面积（1.13 cm2）。

以累积透过量Qn为纵坐标，时间t为横坐标作图，结果见图8。将数据分别用零级方程、一级方程、Higuchi 方程拟合［19］。结果显示三种指标成分均符合零级方程和Higuchi 方程，表明复方精油具有缓控释效果。

图8 桉油精、樟脑、龙脑的累积透过量

对三种指标成分的Qn-t 曲线中的直线部分进行线性回归，求出的直线斜率即为稳态透皮速率（Js）［20］。由表3 结果可知，桉油精、樟脑、龙脑在复方精油中的透皮速率分别为34.442、88.515、35.213 µg·cm-2·h-1。

表3 指标成分的渗透动力学参数

3 讨论

精油具有高渗透性、代谢快、不滞留，毒性小，又易于透过血脑屏障的优点［21］，可广泛适用于颈肩痛患者。中药精油的止痛作用机制是通过多种途径实现的，有研究表明芳樟醇可促进神经递质抑制剂的增加起到调节中枢来达到缓解慢性疼痛的作用［22］，α-蒎烯能阻止NF-κB 炎症通路的传导和白细胞介素-6（IL-6），肿瘤坏死因子-α（TNF-α），一氧化氮NO 的释放达到抗炎镇痛的作用［23］；桉油精通过调节氧化应激和抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）生成，从而减轻疼痛［24］；樟脑的镇痛作用则其可能与作用于TRPV1 通道有关［25］。

通过GC-MS 分析与网络药理学预测结果所得的治疗颈肩痛的关键活性成分基本重合。活性成分通过抑制5-羟色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）的释放调节中枢神经以此镇痛；抑制炎症因子NO、IL-6、TNF-α 的合成释放从而抗炎镇痛；抑制环氧合酶-2（COX-2）的表达缓解疼痛。选取桉油精、樟脑和龙脑作为指标性成分，透皮试验结果显示释放数据均符合零级动力学方程和Higuchi 方程，表明复方精油的体外透皮行为均具有缓释作用。

综上所述，复方精油通过多种成分和靶点相互调节治疗颈肩痛的发作机制，且透皮吸收具有控缓释效果。为进一步研究精油的止痛作用和剂型研究提供参考。