超高效液相色谱-串联质谱法同时测定草莓中咯菌腈和异菌脲残留量

赵圣英，高祥文，于建垒，刘同金，梁 慧，房 锋*，李瑞娟*

（1.山东仕邦农化有限公司，济南 250100；2.山东省农业科学院植物保护研究所，济南 250100）

咯菌腈（Fludioxonil），化学名称为4-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧-4-基)吡咯-3-腈，属于触杀性苯基吡咯类杀菌剂，其作用机理主要通过抑制分裂蛋白活化激酶/组氨酸激酶活性，影响真菌分生孢子萌发、芽管伸长及菌丝生长，可以防治小麦、玉米、蔬菜等作物的大部分真菌病害[1-2]。异菌脲（Iprodione），化学名称为3-（3，5二氯苯基）-1-异丙基氨基甲酰基乙内酰脲，是一种高效、广谱的二甲酰亚胺类触杀型杀菌剂，兼具保护和治疗作用，其作用机理是抑制蛋白激酶，控制许多细胞功能的细胞内信号，抑制真菌孢子的萌发、产生和菌丝生长，主要用于防治草莓、葡萄、马铃薯等作物的灰霉病、早疫病、黑斑病等真菌病害[3]。

目前，咯菌腈和异菌脲残留检测分析方法主要有气相色谱法、气相色谱质谱联用法、液相色谱法、液相色谱串联质谱法等，基质主要包括黄瓜、葡萄、番茄、桃等[4-13]，但同时分析草莓中咯菌腈和异菌脲残留的方法尚未见报道。本研究首次建立了咯菌腈和异菌脲在草莓中同时测定的方法，该方法具有操作简便、准确度和精密度高、线性关系良好等特点，为咯菌腈和异菌脲在草莓中的残留降解规律研究、风险评估及安全使用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试剂

咯菌腈标准品（纯度99.7%）、异菌脲标准品（纯度99.3%），上海安谱璀世标准技术服务有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），美国TEDIA公司；硫酸镁（分析纯）、氯化钠（分析纯）、柠檬酸钠（分析纯）、柠檬酸二钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；PSA（N-丙基二胺，40～60 μm）、GCB（石墨化碳黑，120～400目），博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 仪器

Waters Hclass/xevo TQD超高效液相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪，沃特世科技（上海）有限公司；ME204万分之一电子天平、ME802百分之一天平，梅特勒托利多科技（中国）有限公司；Heraeus Multifuge X1R离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；UMV-2漩涡混合器，北京优晟联合科技有限公司。

1.3 试验材料

草莓品种为‘甜宝’，山东省农业科学院济阳试验示范基地。

1.4 样品前处理

准确称取10.0 g草莓浆液（精确至0.1 g）于50 mL塑料离心管，加入10 mL乙腈，4 g硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠，0.5 g柠檬酸氢二钠，加入陶瓷均质子，盖上离心管盖，剧烈振荡1 min后，4 200 r/min离心5 min，取5 mL上清液加入含有885 mg硫酸镁，150 mg PSA，20 mg GCB的15 mL离心管中，涡旋混匀1 min，4 200 r/min离心5 min，吸取上清液经0.22 μm滤膜过滤，用超高效液相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪测定。

1.5 仪器分析条件

（1）液相色谱条件。色谱柱为ACQUITY UPLCBEH（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱温为35℃；进样量为4 μL，流动相A、B分别为乙腈和0.1%甲酸水溶液；流速为0.4 mL/min；采用梯度洗脱模式，洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱参数

（2）质谱条件。采集类型为多重反应监测MRM；离子源为电喷雾离子源ESI；扫描方式咯菌腈为负离子，异菌脲为正离子；毛细管电压为E＋/2.5 kV，E-/1.5 kV；离子源温度为150℃；雾化气体为氮气；雾化器压力＜0.690 MPa；撞气体类型为氩气。咯菌腈和异菌脲的质谱参数见表2。

表2 MRM 模式下咯菌腈和异菌脲质谱参数

1.6 标准溶液的配制

分别称取咯菌腈标准品0.010 2 g、异菌脲标准品0.010 4 g（准确至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度为102 μg/mL咯菌腈标准母液、104 μg/mL异菌脲标准母液，于-6℃避光保存。母液用甲醇分别配制成100.0、10.0、1.0 mg/L的混合标准溶液。用草莓空白基质配制1.0、0.3、0.1、0.03、0.01mg/L的系列混合基质标准工作溶液。

1.7 添加回收率试验

GB 2763—2021规定咯菌腈在草莓中的最大残留限量为3 mg/kg[14]，CAC规定异菌脲在草莓中的最大残留限量为10 mg/kg[15]，根据NY/T 788—2018《农作物中农药残留试验准则》[16]的要求，在草莓空白样品中添加0.01、0.3、3.0 mg/kg质量分数的咯菌腈，0.01、0.3、10.0 mg/kg质量分数的异菌脲，每个加标量平行测定5次，采用1.4样品前处理方法和1.5仪器分析条件进行检测，计算加标回收率和变异系数。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂、净化方法的选择

国内对咯菌腈和异菌脲残留检测的样品前处理，多采用乙腈、二氯甲烷等提取，固相萃取法（SPE）和QuEChERS法净化，固相萃取法净化多采用Florisil小柱，QuEChERS法净化多采用PSA和无水硫酸镁。本试验过程中，采用乙腈作为提取溶剂，咯菌腈和异菌脲回收率为83%～105%，乙腈相对二氯甲烷后续净化简便，故采用乙腈作为草莓中咯菌腈和异菌脲的提取溶剂。

以草莓空白样品为基质，添加0.3 mg/kg的咯菌腈和异菌脲标准溶液，采用乙腈提取。当不添加净化剂时，咯菌腈回收率为106%～111%，相对标准偏差（RSD）为1.9%；异菌脲回收率为97%～108%，RSD为3.1%。从表3可知，不同用量的PSA对咯菌腈和异菌脲的回收率差异不大，但当添加量为150 mg时，咯菌腈和异菌脲的RSD最小。随着GCB用量的增加，净化液颜色逐渐变浅，当其用量为20 mg时，净化效果较好，减少了草莓基质对咯菌腈和异菌脲定性和定量的影响，咯菌腈和异菌脲回收率分别为99%～108%和93%～104%，回收率符合农作物中农药残留试验准则的要求。综合考虑，试验选择乙腈提取，150 mg PSA，20 mg GCB对样品进行净化。

表3 不同量PSA 和GCB 对咯菌腈和异菌脲回收率的影响

2.2 质谱和色谱条件优化

分别在电喷雾正离子模式和负离子模式下，对1 mg/L的咯菌腈标准溶液和1 mg/L异菌脲标准溶液进行全扫描，确定待测物的母离子和电离方式，调节毛细管电压和锥孔电压，使母离子信号最强，使用Waters TQD MS手动调谐分析，优化各子离子的碰撞能量等质谱参数，选择2个信号强度较强的子离子作为定性离子，离子丰度最强的子离子作为定量离子。结果表明，在负离子模式下，咯菌腈的［M-H］-信号强度比正离子模式下的［M＋H］＋强，在正离子模式下，异菌脲的［M＋H］＋信号强度比负离子模式下［M-H］-的强。综合考虑，试验选择负离子模式下测定咯菌腈，正离子模式下测定异菌脲，质谱参数见表2。

试验比较了流动相分别为甲醇/水、乙腈/水和乙腈/0.1%甲酸水对咯菌腈和异菌脲的色谱峰形及离子化效率的影响。结果表明，乙腈为有机相时，待测物峰形尖锐对称，无拖尾，且离子化效率高，优于甲醇，以0.1%甲酸水为无机相时，进一步改善峰形，异菌脲的离子化效率提高，咯菌腈的离子化效率有所降低，综合考虑，最终确定优化后的流动相梯度条件见表1。

2.3 标准曲线

在1.5所述的液相色谱质谱条件下，对0.01、0.03、0.1、0.3、1.0 mg/L系列浓度的咯菌腈和异菌脲基质标准溶液分别进样，得到相应的响应值。以溶液质量浓度为横坐标，以其相应的峰面积为纵坐标作图，在0.01～1 mg/L范围内，咯菌腈的标准曲线为y=15 002.5x＋38.39，相关系数为0.99 52，异菌脲的标准曲线为y=64 025.2x＋181.65，相关系数为0.998 8，说明咯菌腈和异菌脲在上述浓度范围内质量浓度与峰面积具有良好的线性关系。

2.4 方法的准确度、精密度和定量限

结果表明（表4）：添加水平为0.01、0.3 mg/kg和3 mg/kg时，咯菌腈在草莓中的平均回收率为83%～105%，相对标准偏差为2.0%～12.1%；添加水平为0.01、0.3 mg/kg和10 mg/kg时，异菌脲在草莓中的平均回收率为93%～101%，相对标准偏差为4.9%～9.4%。其准确度及精密度均满足农药残留分析与检测标准要求。通过添加试验可知，咯菌腈和异菌脲在草莓中残留分析方法的定量限（LOQ）为0.01 mg/kg，符合《农作物中农药残留试验准则》的要求。

2.5 实际样品分析

50%咯菌腈·异菌脲悬浮剂在草莓上的残留试验样品56份，利用本方法进行检测。结果表明，处理区草莓样品中咯菌腈残留量为0.021～0.18 mg/kg，异菌脲残留量为0.22～1.87 mg/kg，对照区样品咯菌腈、异菌脲残留均未检出。因此，咯菌腈残留量低于GB 2763—2021规定的MRL值3 mg/kg[14]，异菌脲残留量低于CAC规定的MRL值10 mg/kg[15]。

3 结论

本研究以乙腈为提取溶剂，通过对样品前处理净化方法、色谱和质谱条件进行优化，首次建立了草莓中同时检测咯菌腈和异菌脲残留量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法。咯菌腈在草莓中的平均回收率为83%～105%，相对标准偏差为2.0%～12.1%，异菌脲在草莓中的平均回收率为93%～101%，相对标准偏差为4.9%～9.4%。该方法操作简便，灵敏度、准确度、精密度均符合《农作物中农药残留试验准则》的要求，为咯菌腈和异菌脲在草莓中残留量的同时测定提供理论参考和技术支持。