四氯虫酰胺对大型溞的急性毒性和繁殖毒性

付瑞强，张燕宁，毛连纲，朱丽珍，蒋红云，刘新刚，张 兰

（中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

四氯虫酰胺（tetrachlorantraniliprole）是国内创制的一种双酰胺类杀虫剂（图1），其对水稻二化螟、稻纵卷叶螟效果优异[1]，对蚜虫类、叶蝉类、飞虱类以及部分鞘翅目和双翅目害虫也具有较好的防效[2]。四氯虫酰胺是以氯虫苯甲酰胺为先导化合物进行结构修饰得到，二者都属于邻甲酰氨基苯甲酰胺类化合物。通过与鱼尼汀受体结合，打开钙离子通道，使细胞内的钙离子持续释放到肌浆中[3]，钙离子和肌浆中基质蛋白结合，进而引起害虫肌肉持续收缩，靶标害虫因此表现为抽搐、麻痹、拒食，最终死亡[4]。

图1 四氯虫酰胺结构式

鉴于双酰胺类杀虫剂的潜在环境风险，四氯虫酰胺对环境和非靶标生物的安全性也需引起关注。有研究证明，四氯虫酰胺对天敌昆虫、家蚕、蜜蜂、水生生物存在潜在风险[5]；张琦等[6]研究证明氯虫苯甲酰胺和四氯虫酰胺2种双酰胺类农药对2龄家蚕毒性均属于中毒，在应用于桑园害虫防治中该农药毒性残留相对其他农药较低，四氯虫酰胺相比氯虫苯甲酰胺对家蚕的毒性更强。且四氯虫酰胺在土壤中不易降解，在pH=7的水中中等光解，其在土壤中也较易被吸附[7]。

大型溞（Daphnia magna）广泛分布于淡水、海水和内陆半咸水中[8]，其作为受试生物的优点为：对环境变化的敏感性高，繁殖周期短，容易培养，体型透明易观察等[9]。本文以四氯虫酰胺设计暴露浓度，进行大型溞生长、发育、繁殖等指标测试，主要包括首胎时长、初次产溞数、单雌总产溞数、产胎数、蜕皮次数、体长等[10]，评价四氯虫酰胺对浮游动物的毒理效应，为四氯虫酰胺使用对水生生物影响的环境风险评估提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

91.3%四氯虫酰胺原药，中国农业科学院植物保护研究所提供；99.9%四氯虫酰胺标准品，天津阿尔塔科技有限公司；乙腈（色谱纯），Fisher公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；乙腈（分析纯），北京市通广精细化工公司；甲酸（分析纯）、氯化钠（分析纯）、无水硫酸镁（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

万分之一天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；人工气候箱，宁波海曙赛福仪器厂；150 mL烧杯，北京广达恒益科技有限公司（北玻博美）；体式镜OLYMPUS SZX10，广州市明美光电技术有限公司；全温度光照振荡器DHZ-DB，宁波海曙赛福仪器厂；超高效液相色谱仪Agilant 1290-DAD，美国安捷伦科技有限公司；三重四极杆质谱仪SCIEX TRIPLE QUAD 3500，SCIEX 公司；高速离心机75007211，Thermo公司。

1.2 试验生物

大型溞，引自农业农村部农药检定所，于室内多年饲养。饲养温度为（22±1）℃，L//D=16 h//8 h，每24 h投喂一次近头状尖胞藻（Pseudokirchneriella subcapitata）（浓度约为1.00×106个/mL）。

试验用溞为24 h内的非头胎溞，来源于同一母系，且母溞保种培养期间未表现出任何受胁迫现象，例如死亡率高、出现雄溞和冬卵、头胎延迟、体色异常等。试验用溞在试验条件下驯养至少3 w。驯养期间，大型溞的日常培养条件如光照、温度、饲喂量等须与试验条件一致。每24 h投喂一次近头状尖胞藻，每48 h更换曝气自来水。

1.3 仪器分析条件

（1）液相色谱。Agilent 1290 Infinity 型液相色谱仪（UHPLC），SCIEX TRIPLE QUAD 3500质谱仪；色谱柱：Acquity UPLC BEH C18，2.1 mm×50 mm（1.7 μm）；柱温箱：35℃；进样量：2 μL；流动相洗脱：A：0.2%甲酸水，B：色谱纯乙腈。洗脱程序见表1。

表1 液相色谱流动相梯度洗脱参数

表2 MRM 模式下四氯虫酰胺质谱分析参数

（2）质谱分析条件。电离方式：电喷雾电离（ESI），负离子；多反应监测（MRM）模式；离子源喷针电压（IS）：4 500.0V；离子源温度（TEM）：500.0℃；碰撞气（CUR）：68.95 kPa；气帘气（CAD）：55.16 kPa；离子源气1（GS1）：344.75 kPa；离子源气2（GS2）：413.7 kPa。

1.4 四氯虫酰胺标准曲线绘制

用电子天平准确称取1.01 mg四氯虫酰胺标准品，用乙腈做溶剂，配制100 mg/L的储备液10 mL，继续用乙腈分别稀释成0.30、0.50、1.00、3.00、6.00、10.00 μg/L的系列标准溶液，在1.3的条件下进行测定，以峰面积和进样浓度为纵、横坐标做图，得到四氯虫酰胺标准溶液线性回归曲线。

1.5 水样中四氯虫酰胺检测

量取10 mL水样于50 mL离心管中，加入10 mL萃取液（0.2%甲酸乙腈），在振荡机上振荡提取15 min后，加入氯化钠1 g，无水硫酸镁4 g，摇匀后再次振荡提取5 min。置于台式高速离心机以4 000 r/min离心5 min，分液后移取8 mL上清液至10 mL离心管中，吸取适量上清液过0.22 μm有机滤膜待测。

1.6 试验中暴露溶液的配制

准确称取91.30%的原药10.95 mg溶于50 mL水中，加入100 μL丙酮后超声助溶，并定容至100 mL，得到母液浓度为100 mg/L的试验药液，应用于急性毒性试验和繁殖毒性试验。

1.7 急性毒性试验

参考经济合作与发展组织（OECD）化学品测试准则202[11]和童丽丽等[12]的方法并稍作改进。用1.6中母液稀释为1 mg/L后，配制急性毒性试验浓度依次为0、1.00×10-3、1.50×10-3、2.30×10-3、3.00×10-3、4.00×10-3、6.00×10-3mg/L的四氯虫酰胺溶液。其中曝气水为空白对照组，0.1%丙酮为溶剂对照组。在每个150 mL烧杯中加入供试药液75 mL和5只幼溞（出生6～24 h之内的非头胎溞），每处理设置4个平行试验共20只小溞。急性毒性试验期间不喂食，培养条件同1.2小节所述。分别在24 h和48 h观察并记录大型溞的活动受抑制情况（或死亡率），并分析急性毒性结果。

1.8 繁殖毒性试验

参考经济合作与发展组织（OECD）化学品测试准则211[13]进行试验并稍作修改。根据1.6中的急性毒性试验结果，参照48 h-EC50值1.31×10-3mg/L，分别设置1.25×10-6、6.25×10-6、2.50×10-5、5.00×10-5、1.00×10-4mg/L 5个暴露浓度，设曝气水为空白对照组，同时设置0.1%的丙酮为溶剂对照，每个处理设置3个平行试验。在每个150 mL烧杯中加75 mL试验药液，每个烧杯中饲养1只溞，每24 h喂食一次，间隔48 h更换试验药液。

试验周期为21 d，期间培养条件同1.2小节，每24 h统计大型溞首胎时长、蜕皮次数、产小溞数、产胎数，并记录21 d内的死亡率和单雌总产溞数。在试验的最后1 d即第21 d，在体式镜下测量存活大型溞的体长（含肛刺）。

1.9 数据处理

采用胡好远等[14]的方法计算种群内禀增长率；IBM SPSS Statistics 19软件分析四氯虫酰胺对大型溞急性毒性和繁殖毒性数据。

2 结果和分析

2.1 试验药液中四氯虫酰胺稳定性分析

在0.3～10 μg/L范围内，质量浓度与对应的峰面积间呈良好的线性关系，其线性回归方程为y=3705.1x＋65.552，R2=0.9972。根据测定的质量浓度，换算得四氯虫酰胺的质量浓度（表3）。结果表明，所测定的0.50、3.00、6.00 μg/L浓度处理组0 h和48 h的实测浓度与理论浓度的偏差小于20%。因此，本研究中大型溞急性运动抑制试验过程中可不更换药液，在繁殖毒性试验21 d暴露过程中每48 h更换一次药液。

表3 四氯虫酰胺在试验水样中48 h 实测浓度

2.2 急性毒性

在大型溞急性毒性试验中，空白对照组及溶剂对照组大型溞均活动正常，无死亡。证明此次试验选用的大型溞状态良好，试验结果可靠。其具体受抑制情况如表4所示。

表4 四氯虫酰胺大型溞急性毒性试验结果

根据表4，以IBM SPSS Statistics 19进行分析，得到四氯虫酰胺对大型溞急性毒性试验测定结果如表5，依据GB/T 31270.13—2014《化学农药安全评价试验准则第13部分：溞类急性活动抑制试验》[15]中的毒性分级标准，四氯虫酰胺对大型溞急性毒性等级为剧毒。

表5 四氯虫酰胺对大型溞急性毒性试验48 h 测定结果

2.3 繁殖毒性

试验进行到21 d时，空白对照组及溶剂对照组中大型溞存活率为80%，表明试验结果可靠。由表6可以看出四氯虫酰胺可影响大型溞的首胎时长，空白对照组与5.00×10-5mg/L和1.00×10-4mg/L处理组有显著差异（p＜0.05），两个浓度组使大型溞的首胎时长显著缩短；对初次产溞数来说，2.50×10-5、6.25×10-6、1.25×10-6mg/L 3个处理组间差异不显著。四氯虫酰胺暴露，缩短了大型溞首胎时长，而对其初次产溞数有低浓度促进，高浓度抑制的现象。

表6 四氯虫酰胺对大型溞首胎时长和初次产溞数的影响

表7为四氯虫酰胺对大型溞单雌总产溞数和平均产胎数的影响。由表中数据可以看出，各浓度处理组对单雌总产溞数无显著影响。浓度为1.25×10-6～5.00×10-5mg/L的单雌总产溞数多于对照组单雌总产溞数，但浓度达到1.00×10-4mg/L时，单雌总产溞数降低；对于单雌平均产胎数来说，四氯虫酰胺显著促进其产胎，5个浓度的处理组平均产胎数均高于两对照组，其中，2.50×10-5、5.00×10-5mg/L和1.00×10-4mg/L处理组相比2个对照组有显著差异。

表7 四氯虫酰胺对大型溞单雌总产溞数和平均产胎数的影响

表8为四氯虫酰胺对大型溞蜕皮次数和体长的影响。由表中数据可以看出，随着浓度的升高，大型溞21 d体长无显著差异；而四氯虫酰胺对大型溞平均蜕皮次数也无显著影响。

表8 四氯虫酰胺对大型溞蜕皮次数和体长的影响

采用胡好远等[14]的方法计算种群内禀增长率，由表9可看出四氯虫酰胺暴露后，其种群内禀增长率无明显变化，空白对照和溶剂对照内禀增长率均为0.24；5个药剂处理的内禀增长率为0.23～0.25，表明该试验浓度的持续暴露不会影响大型溞种群的繁衍。

表9 四氯虫酰胺对大型溞种群内禀增长率的影响

3 结论

四氯虫酰胺在土壤中的残留期比较长，移动比较活跃，所以一旦该药在环境中富集到一定浓度，就会对非靶标生物乃至其他生物产生慢性毒性[16]。本研究以四氯虫酰胺为供试药剂，以大型溞为评估对象，研究了该药剂对大型溞的急性毒性及繁殖毒性。急性毒性结果显示，四氯虫酰胺对大型溞EC50为1.31×10-3mg/L，表明该药剂对大型溞急性毒性等级为剧毒。在供试药剂暴露21 d后，评估其对大型溞的生长发育和繁殖的影响，试验数据表明，四氯虫酰胺对大型溞的繁殖存在一定毒性：5.00×10-5、1.00×10-4mg/L浓度组使大型溞的首胎时长显著提前，而对其初次产溞数有低浓度促进，高浓度抑制的现象。各浓度处理组对单雌总产溞数无显著影响，处理组单雌总产溞数稍多于空白对照组单雌总产溞数。对于平均产胎数来说，2.50×10-5、5.00×10-5mg/L和1.00×10-4mg/L浓度处理组显著促进其产胎。但是其对大型溞的体长无显著抑制作用，随着浓度的升高，大型溞体长无显著变化。四氯虫酰胺对大型溞平均蜕皮次数也无显著影响。本研究结果表明，四氯虫酰胺对大型溞体长、蜕皮次数、单雌总产溞数无显著影响，对首胎时长和平均产胎数有促进作用，而对种群繁衍无不良影响。综上，四氯虫酰胺在农业生产上使用对大型溞存在潜在风险，有必要进一步进行包括生态毒理学风险评估在内的一系列试验。