黄鳍棘鲷MSTN1 基因多态性与生长性状的关联分析

■ 文｜珠海市现代农业发展中心 于方兆 盘润洪 李望东 李勇 杨会兵 郭建谊

中国水产科学研究院南海水产研究所 朱克诚 郭华阳 刘宝锁 张殿昌

一、前言

黄鳍棘鲷（Acanthopagrus latus），在分类学上隶属于鱼纲（Pisces），鲈形目（Perciformes），鲷科（Sparidae ），棘鲷属（Acanthopagrus），广泛分布于红海、阿拉伯海、印度洋、西太平洋沿岸和中国台湾、福建、广东、广西沿海。黄鳍棘鲷通常在靠近岸边的海域和河口湾生活，为杂食性鱼类，是国内一种重要经济鱼类。但黄鳍棘鲷从鱼苗到成年所需的养殖周期较长，一般要经过一年至一年半培养，才能成长到上市规格。近些年来，因为过度捕捞、环境污染等情况使得黄鳍棘鲷自然种群物种质量出现严重衰退问题；同时由于黄鳍棘鲷养殖群体的近亲繁殖、小规格亲本人工育苗等原因，令养殖的黄鳍棘鲷种群物种质量退化程度更严重，免疫力下降，养殖黄鳍棘鲷利润减少等，因此急需进行黄鳍棘鲷的良种选育工作。分子标记辅助选择育种是目前常用的物种选育手段之一，与目标性状基因紧密连锁的分子标记可以用来对目标性状进行关联分析，可以明确候选的分子标记与个体表型间的关系，进一步缩短育种年限。

水产养殖收益的检验指标之一是种群的生长速率，其受到物种本身的基因型和生存环境的影响，不同的基因型可能会改变蛋白质的表达速度和数量，而处于温度过高或过低、食物匮乏的环境中生存的生物无法以最大生长速度生长。环境可能会抑制鱼类的生长速率，但鱼类的最大生长潜力最终由基因型决定。随着生物技术的不断创新发展和遗传学的深入研究，可以选择分子标记辅助选择育种方法选择鱼类与其它物种的优良性状，提高后代生长速率。近年来分子标记辅助选择育种方法在全世界兴盛，它通过利用已知功能的候选基因间接选择目标性状，挑选得到目的性状的基因型，结合传统育种手段选育出带有目的性状品种。与传统育种相比，它能更方便且准确地选择隐性的优良性状，具有选择准确度高、育种年限短、受环境影响小等一系列的优点。

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是一种遗传标记，SNP具有许多特点，一是数量多且分布广泛。就人类基因组而言，SNP遍布整个基因组中，几乎每1900bp的片段中就会包含一个SNP位点，正是由于数量巨大的SNP，从而弥补了基因组多态性的不足。二是富有代表性，一些SNP位于基因内部编码区，这些位点的不同分型可能对基因的表达产生影响，改变蛋白质结构和功能，这类SNP可作为目标性状的分子选育位点。三是检测方法简单，规模化实验及检测自动化方面要求低，可以大大缩短工作时间。SNP的碱基类型只有两种，即双等位基因。由于SNP具有双等位基因的特性，在对SNP位点进行检测时只需对其两种碱基进行实验分析，不需要把其所在DNA片段整段测序分析。四是遗传稳定性高，SNP是单核苷酸突变，突变率较低，与微卫星等重复序列标记相比，具有更高的遗传稳定性，因此被广泛应用于和水产动物生长性状相关联的研究中。本研究筛选得到黄鳍棘鲷MSTN1基因中分型稳定、多态性好的SNP位点，并与黄鳍棘鲷生长性状作关联性分析，为黄鳍棘鲷分子标记辅助育种进程及生长性状相关基因研究提供理论基础。

二、材料与方法

1.实验材料

黄鳍棘鲷（平均体重26.88±7.21g，平均体长10.08±0.96cm）来源于中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地。

（1）实验所需仪器

本研究使用的仪器包括超低温保存箱（DW-86L338J，青岛海尔股份有限公司）、冰箱（BCD-205TBDZ，青岛海尔股份有限公司）、不同最大量程的移液枪（Eppendorf）、涡旋振荡仪（Vortex-Genie2，美国SI仪器公司）、微量离心机（Legend Micro21，赛默飞世尔科技公司）、分析天平（ClassicL，梅特勒-托利多公司）、电热恒温水槽（DK-8D，上海一恒科技有限公司）、高速冷冻离心机（Multifuge X1R，赛默飞世尔科技公司）、电子秤（YH-C，上海英衡电子秤有限公司）、电泳仪（DYY-6C，北京六一生物科技有限公司）、梯度PCR仪（MastercyclerRep gradient S，Eppendorf）、拍48核酸提取仪（上海玉博生物科技有限公司）、全自动数码凝胶图像分析系统（Tanon3500，上海天能公司）、烧烤型微波炉（LG）、高压灭菌锅（GR85DR，Zealway）、-25℃医用低温箱（DW-YL270，中科美菱）。

（2）实验所需耗材和试剂

本研究使用的试剂和耗材包括磁珠法DNA提取试剂盒（D6310-0 3 B，上海玉博生物科技有限公司）、6×Loading Buffer（9156，北京宝日医生物技术有限公司）、DL2,000DNAMarker（3427A，北京宝日医生物技术有限公司）、无水乙醇（广州普博公司）、Gelred核酸染料（广州普博公司）、TB GreenRPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（RR820A，北京宝日医生物技术有限公司）、不同量程移液枪枪头等耗材（北京普博欣生物科技有限责任公司）、琼脂糖（111860，上海微科生物技术有限公司）等。

2.实验方法

（1）用于进行生长性状关联性分析研究的样品采集

随机挑选健康的，有活力的，同池塘养殖的黄鳍棘鲷171尾，测量其体长、体重等数据，做好记录后取其尾鳍放入装有无水乙醇的样品瓶中，并做好标记。

（2）黄鳍棘鲷DNA的提取

取浸泡在无水乙醇中的黄鳍棘鲷尾鳍样品，用吸水纸擦干后剪下20mg样品放入1.5mL离心管中用剪刀剪碎，后续提DNA操作用拍48核酸提取仪按上海玉博生物科技有限公司的磁珠法DNA提取试剂盒说明书的步骤提取DNA。将提取后的DNA溶液用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，分析凝胶条带，检查DNA的提取质量。

（3）MSTN1基因扩增和测序

基于黄鳍棘鲷基因组序列，应用 Primer5软件设计多对引物扩增 MSTN基因（表1），研究采用100μL反应体系进行PCR扩增，含 2×PCRMIX50μL，正反向引物各2μL，DNA模板6μL，ddH2O40μL。实验开始前先进行温度梯度PCR确定引物的最适退火温度，PCR反应设置信息：先在94℃下预变性4min；按此设置循环30次：94℃变性40s，最适温度退火40s，72℃延伸90s；循环结束后在72℃下延伸10min（若扩增片段长度<600kb，设置改为：94℃预变性4min；按94℃变性30s，最适温度退火30s，72℃延伸40s的时长循环30次；最后72℃延伸10min），延伸结束后在4℃保存。将PCR扩增结束后的DNA溶液用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，分析凝胶条带，随后将pcr产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

表1 本研究所设计引物的相关信息

（4）SNP位点的筛选和分型

根据体重数据，将10份黄鳍棘鲷大鱼DNA样品和10份小鱼DNA样品进行 PCR扩增和测序后，用ClustalX软件比对测序结果，筛选MSTN1基因中多态性较高的位点。根据筛选出的SNP位点，用Chromas软件查看位点所在位置的测序峰图，并对该位点进行分型。基因型根据峰图决定，当峰图为单峰或双峰中低峰峰值高度不到高峰一半时，此位点基因型认定为是纯合；当双峰中低峰峰值高度达到或超过高峰峰值的一半时，此位点基因型则认定为是杂合（图1）。

图1 MSTN1 SNP819位点三种基因型峰图

（5）SNP位点和生长性状的关联性分析

根据黄鳍棘鲷基因组序列设计包含SNP位点的短扩增引物（表1），对用于性状关联性分析的171份黄鳍棘鲷DNA样品进行扩增和测序。重复上述步骤后，利用excel表格记录每个SNP位点在样品序列中的位置和对应的基因型。使用SPSS Statistics软件对SNP位点与黄鳍棘鲷各项生长性状进行单因素ANOVA（one-way ANOVA）分析，分析与各项生长性状间是否存在显著性差异（P<0.05）。

三、结果与分析

1.基因组DNA质量

提取的黄鳍棘鲷鳍条的基因组DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，部分样品的电泳检测结果见图2。图中可见提取的基因组DNA条带明显且无拖带现象，完整性较好，没其它杂带，提取结果优良。

图2 黄鳍棘鲷部分样品DNA电泳结果图

2.黄鳍棘鲷MSTN1基因多态性与生长性状关联性分析

采用上述引物扩增来获得黄鳍棘鲷MSTN1全长序列，混池测序发现MSTN1基因的内含子存在1个SNP位点，将其命名为SNP819。

再以M1-SNP-R1/L1的引物对进行扩增，扩增后使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶图中有均一条带的样品进行测序。根据测序峰图判断潜在的SNPs位点，接着随机选取养殖的黄鳍棘鲷个体171尾，并进行基因分型。

经过线性模型分析后，SNP819位点不同基因型与生长性状的关联分析结果如表2中所示。

表2 SNP819 位点不同基因型与生长性状的关联分析

综上所述，从表1 中可知，自5’端起第819位，其碱基为A或T的SNP位点的AA和AT基因型个体的躯干长大于TT基因型个体（P<0.05）；SNP位点的AA和AT基因型个体的尾长大于TT基因型个体（P<0.01）；SNP位点的AA和AT基因型个体的体长大于TT基因型个体（P<0.01）；SNP位点的AA和AT基因型个体的尾鳍长大于TT基因型个体（P<0.05）；SNP位点的AA和AT基因型个体的全长大于TT基因型个体（P<0.01）。

肌肉生长抑制基因（Myostatin）是控制动物骨骼肌生长的主要基因，属于转化生长因子β（TGF-β）超家族，并包含TGF-β前肽域和TGFB域，MSTN基因通过抑制生肌决定因子（MyoD）的转录活性抑制肌细胞增殖和分化，限制肌纤维的数量和大小。该基因最先从小鼠骨骼肌的cDNA文库中筛选获得。当MSTN基因发生突变会导致肌细胞增生、肌纤维肥大，比如敲除MSTN基因的斑马鱼的肌肉比对照组的明显发达；向大黄鱼幼鱼注射MSTN1前肽基因其增重率显著降低。此外还有真鲷、金头鲷等均发现MSTN基因中突变位点与生长性状之间存在着相关性。

采用单因素方差分析不同基因型（频率低于2.5%的基因排除）与生长性状的相关性。结果表明，MSTN1 SNP819中TT基因型体长和全长显著小于 AT和 AA基因型，为劣势基因型。因此，本结果表明SNP-819位点可应用于以快速生长为目标的黄鳍棘鲷育种材料早期筛选，能够有效提高育种的效率和缩短育种年限。