基于网络药理探讨菟藤方治疗结直肠癌的作用机制

王曦妤 吴 行 石 齐 曾海伦 侯风刚

（1 上海中医药大学附属宝山医院，上海 201999；2 上海市静安区中医医院，上海 200072；3 上海中医药大学附属市中医医院，上海 200071)

中医药已成为结直肠癌综合治疗中不可或缺的部分，被社会广泛认可，需求巨大[1-2]。侯风刚教授认为转移性肠癌病机在于“肾虚毒结，挟湿挟瘀”[3-4]，以“补肾解毒，祛湿化瘀”为治法的经验方——菟藤方（TTF），临床研究发现能延长患者生存期[5]，但其作用机制仍需进一步研究。本研究基于网络药理学筛选TTF的活性成分和潜在作用靶点，分析关键蛋白涉及的生物学功能及信号通路，为进一步揭示菟藤方抑制结直肠癌侵袭转移的药理机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 中药潜在有效成分及作用靶点筛选 登录中药数据库及分析平台系统药理学（TCMSP）[6]，搜索菟藤方中的菟丝子、藤梨根、桑寄生、蛇舌草、预知子、芡实、黑豆这7味中药的潜在活性成分及潜在成分作用靶点。筛选标准：口服生物利用度（OB）≥30%，类药药性（DL）≥0.18。虫类药全蝎潜在有效成分及作用靶点筛选，则通过文献[7]及化学专业数据库网查询获得全蝎有效成分的分子结构式。SwissADME网站以高胃肠道吸收（GI absorption HIGH）并且在类药性（Druglikeness）的5项评分中（Lipinski、Ghose、Veber，Egan、Muegge）至少两项为yes的成分作为筛选标准，确定全蝎的潜在有效成分，建立菟藤方活性成分——靶点数据库。

1.2 肠癌相关基因整合 整合GeneCards[8]、OMIM[9]、PharmGkb[10]、TTD[11]、DrugBank，数据库肠癌相关基因合并，得到肠癌基因数据库。

1.3 中药复方调控网络 通过UniProt[12]数据库，将TCMSP获得的药物作用靶点的基因全称转化为gene symbol——基因名称的唯一缩写。再将菟藤方活性成分—靶点数据库与肠癌基因数据库取交集，得到菟藤方作用于肠癌的相关基因。Cytoscape绘制“中药有效成分——靶点基因”调控网络图。

1.4 蛋白互作网络（PPI）通过String网站，物种选择人类，设置置信度=0.7，隐藏落单节点进行筛选，构建“菟藤方-肠癌”靶点蛋白互作网络，并将数据导入Cytoscape，使用CytoNCA 插件优化。选择插件里的中介中心性、接近中心性、点度中心性、特征向量中心度、局部平均连接、网络中心性这6项参数进行打分过滤，得分均大于中位数的基因保留，筛选两次后保留的基因定义为PPI网络核心基因。

1.5 GO生物过程富集分析及KEGG通路富集分析 使用R软件中的Goplot插件，调用GO及KEGG数据库[13]，富集菟藤方作用于肠癌的相关基因的通路信息，以P＜0.05 为显著富集标准。

2 结果

2.1 菟藤方的潜在成分及靶点 TCMSP数据库筛选出菟藤方的潜在有效成分分别为菟丝子11种、藤梨根6种、桑寄生2种、蛇舌草7种、预知子6种、芡实2种、黑豆13种；文献及各数据库筛选全蝎潜在活性成分12种，各中药潜在有效成分表见表1。对潜在有效成分进行靶点预测，分别为菟丝子10种、藤梨根6种、桑寄生2种、蛇舌草5种、预知子4种、芡实2种、黑豆12种、全蝎12种，共得到1 630个作用靶点。

表1 菟藤方潜在有效化学成分

2.2 肠癌相关基因数据库 菟藤方筛选出的1 630个潜在作用靶点，通过UniProt数据库将基因全称转换gene symbol后，剔除重复值，剩余319个靶点基因，与5个数据库筛筛选获得的9 550个肠癌相关基因取交集，得出菟藤方作用于肠癌的潜在有效靶点基因241个。

2.3 菟藤方的成分靶点调控网络 Cytoscape创建菟藤方—潜在有效成分-潜在靶点互作网络，见图1。其中多个活性成分具有相同的潜在作用靶点，按度值降序排列，前三为PTGS1、PTGS2、NCOA2，分别是20、19、19个潜在有效成分的共同作用靶点。每个潜在有效成分均有多个潜在作用靶点，按度值降序排序，前三分别是槲皮素（MOL000098）、甘氨酸（MOL000050）、山柰酚（MOL000422），分别存在131、56、48个潜在作用靶点。

图1 菟藤方—潜在有效成分-潜在靶点调控网络.最外圈节点的颜色代表不同中药，圆形内Mol id代表潜在有效成分，内圈方形节点代表菟藤方治疗肠癌的潜在靶点基因，颜色（淡黄到深红）及大小与度值成正比。

2.4 菟藤方的蛋白互作网络 String数据库筛选查询到有219个节点，1 508条边的蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI），CytoNCA 插件二次筛选结束时有23个核心节点和194条边，见图2。

图2 PPI网络的拓扑筛选过程.节点表示不同的靶点基因产生的所有蛋白，边代表蛋白质与蛋白质之间的功能连接。219个节点（蓝色）经过第一次筛选保留58个节点（红色），第二次筛选保留23个节点（黄色），作为核心节点。

2.5 GO生物过程富集分析及KEGG通路富集分析 将241潜在有效靶点基因进行GO生物过程富集分析，富集到BP 2 552个条目，排名前30的富集结果主要涉及对营养物质的反应、炎性反应及对缺氧的反应，氧化应激反应等，见图3A。KEGG通路富集分析的最终富集了189个条目，排名前30的富集结果见图3B，其中与肠癌相关的信号通路，如TNF信号通路（hsa04668）、HIF-1信号通路（hsa04066）、结直肠癌通路（hsa05210）等。菟藤方在HIF通路中涉及21个靶点，并绘制了相关靶点图，见图4。

图3 (A)菟藤方作用于肠癌的GOBP富集分析。图片展示了根据q value＜0.05筛选后排名前30的GO生物过程富集结果。纵坐标代表生物功能的名字，横坐标代表富集在GO上的基因数，q value代表P值调整后的富集的显著性，红色越深代表富集的程度越高。(B)菟藤方作用于肠癌的KEGG通路富集分析.图片展示了根据q value＜0.05筛选后排名前30的KEGG通路富集结果。横坐标代表富集通路上的基因数目，纵坐标代表通路或相关疾病的名称，q value代表P值调整后的显著性，红色越深代表富集的程度越高。

图4 菟藤方治疗肠癌的潜在靶点在HIF-1信号通路上的分布。红色靶点为菟藤方参与此信号通路的靶点分布，白色靶点为该通路其他靶点。

3 讨论

通过网络药理学方法，筛选出菟藤方53个潜在有效成分及241个潜在靶点。其中β-谷甾醇、槲皮素、谷甾醇及豆甾醇为多个中药的共同有效成分。每种有效成分对标多个作用靶点，如槲皮素[14]、甘氨酸、山柰酚、L-丙氨酸及β-谷甾醇，分别存在131、56、48、29及26个潜在作用靶点。同时，不同有效成分也可作用于相同的靶点。如PTGS1、PTGS2、NCOA2、GABRA1和ADH1C就分别对标多个有效成分，分别是20、19、19、13、9个，表明菟藤方通过多成分协同作用产生疗效。本研究对PPT蛋白互作网络进行了两次筛选，最终保留23个核心节点，提示这些靶点表达蛋白之间的相互作用可能是促使菟藤方抑制肠癌侵袭转移的关键。

经过GO生物功能富集分析及KEGG富集分析，分析排名前30受菟藤方显著影响的生物功能及信号通路，发现相关生物功能集中在对营养物质的反应、炎性反应、氧化应激反击，对缺氧的反应等[15]；信号通路中与肠癌相关的包括肿瘤坏死因子信号通路、结直肠癌通路、肿瘤蛋白聚糖通路、HIF信号通路[16]、细胞衰老、铂耐药、P53信号通路。课题组前期研究发现中药的作用与HIF-1α密切相关[17]，基于此筛选出菟藤方治疗肠癌的潜在靶点在HIF-1信号通路上的分布，发现菟藤方涉及的该通路上21个靶点[18]。

综上所述，菟藤方中含有的槲皮素、β-谷甾醇、甘氨酸、山柰酚及L-丙氨酸等53个潜在有效成分可能作用于AKT1、PTGS2、VEGFA、JUN等241个潜在靶点，通过这些靶点基因表达蛋白之间的相互作用，激活HIF1信号通路、肿瘤蛋白聚糖通路及p53信号通路等，从而调控营养水平、氧化应激反应、缺氧反应、炎性反应等细胞生物学行为，在肠癌治疗中起作用。菟藤方具有多成分、多靶点、多通路治疗结直肠癌的作用，而HIF-1信号通路可能是菟藤方延长晚期肠癌患者生存期的关键通路之一。