枯草芽孢杆菌对藜麦霜霉病的防治效果及其促生和改善土壤真菌群落作用

秦楠　周建波　吕红　任璐　陈亚蕾　田淼　殷辉　赵晓军

摘要：为研究枯草芽孢杆菌菌株LF17对藜麦霜霉病的防治效果及其促生和改善土壤真菌群落的作用，根施LF17菌剂进而测定不同处理藜麦苗主要农艺性状指标（茎长、根长、鲜质量、干质量等）；采用宏基因组测序技术分析不同处理的真菌群落结构；通过田间喷施LF17菌剂研究其对霜霉病的防治效果。结果表明，处理2的藜麦苗鲜质量和茎长分别比对照提高54.5%、24.2%，穗长和千粒质量分别比对照提高20.4%、29.1%。宏基因组分析结果表明，处理A、处理B与对照共产生751个OTUs，其中A与B共有的OTU数最高；A与B在科与属水平存在差异，A、B与对照相比提高了Plectosphaerellaceae、Pyronemataceae等的相对丰度，降低了Conocybe、Preussia、Stilbella、Fusarium等的相对丰度；聚类分析表明A、B与对照的群落组成有明显差异，说明施用LF17菌剂可以改变土壤中真菌的群落结构，降低土壤中病原菌基数。田间试验表明LF17菌剂对霜霉病的防效为59.59%，显著高于烯酰吗啉、霜霉威盐酸盐等药剂。本研究表明枯草芽孢杆菌LF17对藜麦具有促生作用且对藜麦霜霉病有良好的防治效果。

关键词：枯草芽孢杆菌；藜麦；霜霉病；促生；田间防治

中图分类号：S435.129文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）14-0159-05

藜麦（Chenopodium quinoa）为藜属的一年生双子叶植物，其单体作物即可满足人体所需的全部营养，是联合国粮食及农业组织（FAO）推荐的全营养食品［1-2］。我国藜麦产业起步较晚，2014年以来，在我国的山西、青海、甘肃、河北等省份开始规模化种植。然而，随着藜麦大面积连作，霜霉病成为生产中的重要病害，严重制约了藜麦产业的发展［3］。藜麦霜霉病致病菌为Peronospora variabilis，致使叶片枯黄脱落，严重地块发病率达95%，减产约40%［3］。目前，化学药剂是常用防治措施，但防治手段单一容易导致抗药性、生态环境恶化等问题。因此，探索生物防治藜麦霜霉病的方法显得尤为重要。

芽孢杆菌是重要的生防资源，这类细菌具有抑制多种植物病原菌的能力，受到国内外学者的研究和关注［4-6］。迄今，国内外研究学者发现藜麦种子中有生防作用的芽孢杆菌最多，包括好氧芽孢杆菌（Bacillus aerophilus）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、南海芽孢杆菌（B. australimaris）、短小芽孢杆菌（B. pumilus）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）。2019年，徐瑛等发现B. amyloliquefaciens菌株11B91能促进藜麦生长，增加其根长、茎长及鲜质量［7］。2022年，赵富清等研究表明B. velezensis菌株LMJB-14的发酵液浸种有助于促进藜麦种子萌发［8］。

目前，鲜有关于藜麦霜霉病生物防治的研究；但是有研究表明生防菌可以用来防治其他作物的霜霉病［9-12］。已筛选出B. amyloliquefaciens、B. megaterium对葡萄霜霉病菌有抑制作用［10］。田间试验发现B. subtilis（菌株B-FS01）的可湿性粉剂对葡萄霜霉病具有良好的田间应用前景，防效与72%霜脲氰·锰锌可湿性粉剂相当［11］。因此，探索B. subtilis对藜麦霜霉病的促生防病作用对生产有着重要的现实和理论意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试生防菌株为1×109 CFU/mL枯草芽孢杆菌水剂（LF17），由山西省农业科学院植物保护研究所植物病害研究室提供。

供试藜麦种子为稼祺505，由山西农谷稼祺种业有限公司提供。

供试化学药剂：供试药剂名称、药剂类型和使用剂量如表1所示。

1.2 试验方法

1.2.1 枯草芽孢杆菌（LF17）对藜麦的促生测定

2020年4月8日，在山西农业大学东阳试验基地温室中，放置180个内径20 cm的盆钵，每行（20盆）为 1个小区，共设置3个处理，3次重复。每盆中播种藜麦种子（稼祺505）3～5粒，待出苗后定植，在处理组藜麦幼苗周围分别均匀根施枯草芽孢杆菌（LF17）菌劑10 mL（处理1）、20 mL（处理2），以喷施20 mL清水处理作为空白对照。每7 d根施1次，共施3次，分别于30 d后将藜麦苗连根挖出，清洗晾干，分别统计藜麦苗茎长、根长、鲜质量及干质量，120 d后统计藜麦穗长和千粒质量。

1.2.2 枯草芽孢杆菌（LF17）对藜麦田根围土壤真菌群落的影响

2022年6月8日，对盆栽藜麦60 d藜麦苗根施LF17菌剂20 mL（A）、菌剂LF17发酵液10 mL（B），以根施20 mL清水作空白对照，每隔7 d根施1次，共3次。30 d后随机选取藜麦苗10株，除去地表层杂物，采集藜麦根系，将根系装入塑料袋，回实验室后抖落根系附着土壤约10 g。移去表层土壤，采集藜麦根部周围土壤，每个处理采集20份土样、充分混匀，用于土壤真菌群落结构的分析。提取样品的总DNA并通过Mini Dorp测定样品DNA的浓度及纯度后，PCR扩增ITS1基因［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.2.3 枯草芽孢杆菌（LF17）和化学药剂对藜麦霜霉病的田间防效试验

2022年7月8日，在山西省忻州市五台县灵境乡灵境村的露地藜麦田进行，试验地面积为 405 m2，周边藜麦种植面积约 66 700 m2。试验地土壤偏碱性，肥力较高，浇水便利，管理水平较好。调查方法：本试验小区面积为15 m2，每小区用药量为 1.25 L；以喷施等量清水处理作为空白对照，共设置 9个处理，3次重复，每隔 7 d 用药1次，连续用药3次。末次药后7 d调查发病情况，记载每张叶片的病级。严重度分级标准为0级：整张叶片无病斑；1级：病斑面积占叶片面积的1%～5%；3级：病斑面积占叶片面积的6%～10%；5级：病斑面积占叶片面积的11%～25%；7级：病斑面积占叶片面积的26%～50%；9级：病斑面积占叶片面积的51%以上。计算病情指数及防治效果。

病情指数=［∑（各级病叶数×相对级数值）/调查总叶数×9】×100；

防治效果=［（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数】×100%。

1.3 数据分析

将测序得到的原始序列进行拼接、去除嵌合体后得到高质量序列，根据序列97%的相似度，使用Usearch软件对有效序列进行聚类分析、划分多个OTU，进而进行序列比对并获得真菌组成。最后构建物种丰度表、绘制群落结构图及层次聚类树（QIIME软件）。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌（LF17）对藜麦的促生作用

2.1.1 对藜麦苗茎长、根长、鲜质量及干质量的影响

根施枯草芽孢杆菌（LF17）30 d后，对照组、处理1、处理2的茎长分别为12.26、13.46、15.23 cm，处理组和对照组之间差异显著，处理2比对照提高24.2%（图 1-A）。对照、处理1、处理2的鲜质量分别为0.55、0.60、0.85 g，处理2与处理1、对照差异显著，处理2比对照提高54.5%；对照、处理1、处理2干质量分别为0.05、0.07、0.08 g，处理和对照差异不显著（图1-B）。

2.1.2 对藜麦穗长和千粒质量的影响

菌剂LF17施用120 d后，对照、处理1、处理2穗长分别为98.00、105.33、118.00 cm，处理2和对照相比差异显著，处理2比对照提高20.4%（图2-A）。对照、处理1、处理2千粒质量分别为78.01、85.34、100.65 g，三者之间差异显著，处理2比对照提高29.0%（图2-B）。

2.2 枯草芽孢杆菌（LF17）对藜麦田土壤真菌群落的影响

由图3可知，本试验的测序量超过40 000读长时曲线趋于平缓，表明取样合理、置信度高，测序深度可反映样品的真菌群落结构。

本研究的3个处理（对照、处理A、处理B）共产生751个OTU，其中共有的OTU為148个，占OTU总数的19.71%。3个处理的OTU数分别为366、478、412个，特有OTU数依次为84、183、127个。两两共有（对照与处理A、对照与处理B、处理A与处理B）的OTU数依次为为220、210、223个，处理A与处理B的共有OTU数最高（图4）。说明施用LF17后丰富了土壤中真菌的群落结构。

不同处理土壤真菌群落在科水平上不同，丰度前5的科分别为织球壳科（Plectosphaerellaceae）、粪绣伞科（Bolbitiaceae）、毛球壳科（Lasiosphaeriaceae）、火丝菌科（Pyronemataceae）、被孢霉科（Mortierellaceae），在处理A、处理B和对照中这5类菌群所占比例分别为47.15%、15.38%、54.47%，其中Plectosphaerellaceae是藜麦田土壤中的主要优势菌群。结果表明施用生物菌剂LF17显著降低了Bolbitiaceae、Lasiosphaeriaceae、荚胞腔菌科（Sporormiaceae）、从赤壳科（Nectriaceae）的相对丰度（图5）。

不同处理土壤真菌群落在属水平上不同，结果表明施用生物菌剂LF17显著降低了锥盖伞属（Conocybe）、柄孢壳属（Podospora）、光黑壳属（Preussia）、轮枝菌属（Gibellulopsis）、束梗孢属（Stilbella）、镰刀菌属（Fusarium）、枝顶孢霉属（Acremonium）、裂壳属（Schizothecium）、赤霉菌属（Gibberella）的相对丰度；其中Conocybe、Preussia、Stilbella降幅最大，分别为26.40%～26.66%、9.08%～9.11%、7.06%～7.18%。同时，施用生物菌剂LF17显著提高了油壶菌属（Olpidium）、枝孢属（Cladosporium）、短柄霉属（Aureobasidium）的相对丰度（图6）。

结果表明，不同处理的土壤真菌群落分为2支，A与B的真菌群落间遗传距离较近，群落组成相似度高，而对照则独立为一支。说明生物菌剂LF17可改变藜麦田土壤中真菌的群落结构，而添加生物菌剂LF17可使藜麦田土壤中的真菌群落向稳定和多样化方向发展（图7）。

2.3 枯草芽孢杆菌（LF17）和化学药剂对藜麦霜霉病的防治效果

供试8种药剂对藜麦霜霉病田间防效为33.23%～59.59%，其中枯草芽孢杆菌LF17（60 mL）和甲霜霜霉威的防效较高，分别为59.59%和50.28%，二者无显著差异；枯草芽孢杆菌LF17（60 mL）与其他6种药剂相比差异显著；枯草芽孢杆菌LF17（30 mL）和枯草芽孢杆菌可湿性粉剂防效较低，分别为33.23%、33.33%，二者无显著差异（图8）。

3 结论与讨论

生物量是评价植株健康状况最直观的指标之一。2022年，李迪秦等的研究表明枯草芽孢杆菌可增强烟草根系体积和根系活力，提高烟草株高、茎围、叶面积等农艺性状指标［12］。本研究表明根施菌剂LF17后，处理2的藜麦苗鲜质量和茎长比对照提高54.5%和24.2%，说明菌剂LF17对藜麦有促生作用。此外，本研究发现处理2的穗长和千粒质量分别比对照提高20.4%、29.1%；表明枯草芽孢杆菌能促进藜麦的生长。

土壤真菌在农业植物病害的发生和发展中扮演着重要角色。董艳辉等的研究表明，重茬使根际土壤微生物降低、病菌数量增多，导致藜麦病害逐年加重［13］。因此，调节土壤真菌群落，是控制藜麦病害的方法之一。李迪秦等发现，枯草芽孢杆菌可提高土壤细菌和放线菌的种群数量，降低真菌的种群数量［12］。本研究通过根施菌剂LF17，减少了土壤中病原菌（Fusarium、Acremonium等）基数，进而控制藜麦病害发生［14］。此外，施用菌剂LF17可增加藜麦田土壤中真菌的种类和数量，使真菌群落多样化。

生产上主要使用化学药剂防治霜霉病，防治措施单一化容易导致病菌抗药性出现。利用生物菌剂来防治霜霉病安全有效，且不易产生抗药性。目前生物菌剂已被应用于黄瓜、葡萄等作物。张淑梅等发现枯草芽孢杆菌 ZH-8菌剂对黄瓜霜霉病的防效为69.12%［15］；申红妙等发现，喷雾枯草芽孢杆菌JL4菌悬液3 d后对葡萄霜霉病的防效为88.0%［16］；李戌彦等报道喷施枯草芽孢杆菌生物菌剂能够降低葡萄叶片的SOD和CAT活性，提高叶片对霜霉病的防治效果［17］。本研究发现菌剂LF17对藜麦霜霉病的防治效果为59.59%，说明可以用菌剂LF17防治藜麦霜霉病。

参考文献：

［1］Zurita-Silva A，Fuentes F，Zamora P，et al. Breeding quinoa （Chenopodium quinoa Willd.）：potential and perspectives［J］. Molecular Breeding，2014，34（1）：13-30.

［2］赵丽娟，闫素月，史晓晶，等. 霜霉病菌侵染对藜麦叶片代谢的影响［J］. 植物病理学报，2021，51（3）：334-339.

［3］殷 辉，周建波，常芳娟，等. 藜麦霜霉病病原菌鉴定［J］. 植物病理学报，2018，48（3）：413-417.

［4］蔡光华，战 峰，王晓玲. 苹果树腐烂病拮抗内生细菌PG-10-8-11v菌株抗菌物质的初步研究［J］. 西南民族大学学报（自然科学版），2011，37（6）：946-949.

［5］Gao S，Wu H，Wang W，et al. Efficient colonization and harpins mediated enhancement in growth and biocontrol of wilt disease in tomato by Bacillus subtilis［J］. Letters in Applied Microbiology，2013，57（6）：526-533.

［6］Chen Y，Yan F，Chai Y R，et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation［J］. Environmental Microbiology，2013，15（3）：848-864.

［7］徐 瑛，郭曉农，蔡德育. 解淀粉芽孢杆菌11B91对藜麦生长影响的初探［J］. 大麦与谷类科学，2019，36（5）：10-14.

［8］赵富清，谢天艳，秦宝福. 藜麦（Chenopodium quinoa）内生菌LMJB-14的鉴定与生防促生功能研究［J］. 生物化工，2022，8（1）：74-76，86.

［9］郭继平，马 光，高小宽，等. 葡萄霜霉病拮抗细菌N22的筛选鉴定及其防效初探［J］. 中国植保导刊，2016，36（4）：9-14.

［10］谢雪迎，王贻莲，扈进冬，等. 葡萄霜霉病拮抗细菌BMJBN02的筛选及其抑菌效果研究［J］. 山东科学，2015，28（3）：39-44，73.

［11］陈 浩，胡梁斌，唐春平，等. 枯草芽孢杆菌B-FS01对葡萄霜霉病的防治效果［J］. 植物保护，2011，37（6）：194-197.

［12］李迪秦，任 铮，祝 利，等. 土壤调理剂与枯草芽孢杆菌菌剂配施对烟草生长发育及病害的影响［J］. 江苏农业科学，2022，50（10）：88-94.

［13］董艳辉，于宇凤，温 鑫，等. 基于高通量测序的藜麦连作根际土壤微生物多样性研究［J］. 华北农学报，2019，34（2）：205-211.

［14］尉天春，薛 婧，姜晓东，等. 藜麦穗腐病病原鉴定及其生物学特性［J］. 福建农林大学学报（自然科学版），2022，51（3）：322-328.

［15］张淑梅，沙长青，王玉霞，等. 枯草芽孢杆菌ZH-8对黄瓜霜霉病防治效果的研究［J］. 生物技术，2004，15（4）：56-57.

［16］申红妙，李正楠，贾招闪，等. 内生枯草芽孢杆菌JL4在葡萄叶上的定殖及其对葡萄霜霉病的防治［J］. 应用生态学报，2016，27（12）：4022-4028.

［17］李戌彦，葛亚琪，杨忠义，等. 3种抑菌剂对葡萄叶片霜霉病的影响差异分析［J］. 山西农业科学，2021，49（2）：224-228.

收稿日期：2022-09-13

基金项目：山西省农业科学院优秀青年基金（编号：YCX2020YQ22）；山西省重点研发计划（编号：2022ZDYF117）；山西农业大学“特”“优”农业高质量发展科技支撑工程课题（编号：TYGC-23）；山西省基础研究计划面上项目（编号：20210302123419）。

作者简介：秦 楠（1987—），男，山西长治人，硕士，助理研究员，从事杂粮作物病害绿色防控研究。E-mail：372909027@qq.com。

通信作者：赵晓军，博士，研究员，从事果蔬、杂粮作物病害病原学、病原菌抗药性及综合治理研究，E-mail：zhaoxiaojun0218@163.com；殷 辉，硕士，副研究员，从事杂粮作物病害研究，E-mail：yinhui0806@ 163.com。