羊肚菌对覆土层理化性质、微生物多样性及群落结构的影响

康超　曾维军　郑旋　王万坤　杨玲　刘忠玄　王晶

摘要：以不同地区及连作土壤为研究对象，利用Illumina MiSeq平台进行高通量测序，分析不同土壤细菌和真菌物种多样性及群落组成，并结合土壤营养指标，探讨羊肚菌菌丝与土壤细菌和真菌群落结构关系。结果表明，栽培地中土壤细菌多样性高于真菌，正常生长羊肚菌可提高土壤碱解氮含量和降低土壤真菌多样性。门水平下，细菌优势菌为放线菌门、变形菌门、绿弯菌门，真菌为子囊菌门、担子菌门、被孢霉门；属水平下，细菌优势属为节杆菌属、鞘脂单胞菌属，连作土壤中真菌优势属为被孢霉属、头束霉属、青霉属；正常生长土壤为被孢霉属、羊肚菌属、头束霉属。土壤全磷与节杆菌属、被孢霉属、头束霉属呈负相关，与镰刀菌属呈正相关，全钾与头束霉属呈正相关，各理化因子与羊肚菌属无明显相关性。

关键词：微生物多样性；羊肚菌；覆土层；连作

中图分类号：S646.701文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）14-0221-08

土壤微生物作为生态系统的重要组成，与其他微生物种群、动植物、环境等因素相互作用，直接或间接地参与土壤物质循环、能量转换等［1-2］。随着农业产业结构的调整和种植规模的扩大，不同农艺措施对土壤本底微生物造成了明显影响［3-7］。食用菌产业是中国农业的重要产业，部分种类（双孢蘑菇、大球盖菇、竹荪等）需要覆土才能出菇，其土壤理化性质及微生物种类对其菌丝生长、原基分化、子实体形成具有重要作用，反之食用菌又影响着土壤理化性质、微生物群落结构等［3，8］。研究表明，双孢蘑菇连作可提高土壤真菌、细菌和纤维素降解菌及有机质、pH值，放线菌则减少［9］，在其扭结期和出菇期时添加鞘氨醇单胞菌属、Dongia、无色杆菌属和假单胞菌可提高双孢蘑菇产量［10］。竹荪覆土层细菌、真菌、放线菌数量随时间增加，pH值、氮、磷、钾、酶活性及肥力也相应变化［11］，熟料栽培覆土层微生物多样性减少［12］，连作则导致土壤微生物数量、功能微生物数量、脲酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、蛋白酶等发生变化，从而影响竹荪正常生长［13］。研究表明［14］，卵孢长根菇在采收期时，覆土层真菌数量最大，细菌呈下降趋势，而病害发生时真菌细菌丰度、土壤营养元素、pH值均降低。对天麻—冬荪轮种覆土微生物进行研究，冬荪菌丝可通过抑制蜜环菌生长，而保持土壤微生物群落结构［15］。

羊肚菌属典型覆土食用菌，为羊肚菌科羊肚菌属真菌［16］。2003年，外援营养袋技术助推了羊肚菌商业化栽培，栽培种类主要为梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌［17］。研究表明，不同海拔地区羊肚菌根际土壤变形菌门和放线菌门为优势类群，且变形菌门与土壤含水量、养分和海拔呈正相关，与pH值、Ca、Mg含量呈负相关；放线菌门与Mg含量、脲酶和芳基硫酸酯酶呈正相关，与Fe、Se、速效钾、土壤脱氢酶和碱性磷酸酶呈负相关［18］。不同土层中，以10～20 cm土层细菌多样性最高，但多数种类丰度较低，以变形菌门、固氮菌为主［19］。熊川等对凉山州野生羊肚菌发生地土样进行分析，其菌塘土壤细菌多样性指数和丰度均高于非菌塘，以Thermosporotrichaceae、黏球菌科和红螺菌科为主要类群［20］。Longley等研究堆肥基质栽培红褐羊肚菌时发现，其分生孢子期（菌霜期）、原基、衰退3个时期，细菌以芽孢杆菌属、拟杆菌属为优势菌；原基衰退和子实体期，真菌优势菌分别为Gilmaniella和头孢霉［21］。比较未栽羊肚菌、正常生长、染病羊肚菌土壤真菌多样性变化，正常栽培后微生物多样性降低，发霉病则增加［22］。以上文献主要考察不同地区野生羊肚菌、不同栽培期及病害发生是栽培羊肚菌根际微生物变化情况，关于不同地区及连作对土壤微生物多样性研究较少。因此，本研究通过高通量测序技术对不同栽培地羊肚菌覆土层根际及羊肚菌连作土样微生物群落组成、多样性等特征进行分析，并结合土壤理化性质变化，探讨羊肚菌菌丝与根际微生物之间的相互关系，为羊肚菌高效栽培提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

2021年12月3日，在贵州省铜仁市石阡县和碧江区羊肚菌栽培基地分别设置样地，标记为石阡县试验组（SQS，羊肚菌连作第2年）、碧江区试验组（BJS，羊肚菌种植第1年），分别以不栽培羊肚菌的土壤为对照组，标记为石阡县对照组（CKS）、碧江区对照组（CKB）。2022年12月13日，每个样地随机设置20 m×20 m样方，采用5点取样法，每个样点直接钻取5～10 cm土层并混合，将土样过2 mm篩网去杂质，保存于4 ℃冰箱和-80 ℃冰箱中，用于土壤理化性质和土壤DNA测定分析。

1.1.2 试剂

FastPfu Polymerase（TransGen，中国）；agArose琼脂糖（Biowest，西班牙）；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen，美国）；NEXTFLEX[KG-*5] Rapid DNA-Seq Kit建库试剂盒（Bioo Scientific，美国）；MiSeq Reagent Kit v3测序试剂盒（Illumina，美国）。土壤基本营养指标检测的相关试剂（分析纯）均购置于成都金山化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.2 DNA提取和PCR扩增

根据 FastDNA[KG-*5] Spin Kit for Soil DNA抽提试剂盒（MP Biomedicals，美国）说明书逐步进行土样微生物群落总DNA抽提，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop 2 000（Thermo Fisher Scientific，美国）测定DNA浓度和纯度。以提取的总DNA为模板，采用细菌通用引物338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，用真菌通用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）对ITS1基因进行扩增。扩增程序如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃稳定延伸10 min，再在10 ℃进行保存。338F-806R引物PCR反应体系为：5×FastPfu Buffer 缓冲液 4.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，上游引物（5 mmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，FastPfu Polymerase DNA聚合酶0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O补足至 20.0 μL。ITS1F-ITS2R引物PCR反应体系为：10×Buffer缓冲液2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs  2.0 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O补足至20.0 μL。

1.2.3 Illumina Miseq测序

将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，美国）进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用QuantusTM Fluorometer（Promega，美国）对回收产物进行检测定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific，美国）进行建库：（1）接头链接；（2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）利用PCR扩增进行文库模板的富集；（4）磁珠回收PCR产物得到最终的文库。利用Illumina公司的Miseq PE300平台（Illumina，美国）进行测序。

1.2.4 土壤理化指标测定

土壤全氮、全磷、全钾、有效磷、速效钾、pH值分别按照NY/T 53—1987、GB/T 9837—1988、NY/T 87—1988、NY/T 1121.7—2014、NY/T 1849—2010、NY/T 1241—1999进行测定；土壤碱解氮按照《土壤学实验》中的碱解扩散法［23］进行测定。

1.3 数据处理

使用Uparse7.0.1090进行OTU分析，聚类方式采用USEARCH7-uparse算法，OTU序列相似度为0.97，物种分类数据库为unite8.0/its_fungi，分类置信度为0.7。使用mothur v.1.30.2计算Shannon指数，并对组间Shannon指数差异进行t检验。使用R语言3.3.1制作群落柱形图。

2 结果与分析

2.1 不同土壤样本理化性质变化

分别在石阡县和碧江区羊肚菌栽培基地采集土样35份，其中，石阡县14份，碧江区21份。石阡县土样为羊肚菌连作土壤，播种羊肚菌后菌丝萌发缓慢，窜土能力差，外援营养袋吃料慢，污染率高；碧江区土样为第1年羊肚菌栽培土壤，其菌丝萌发快，生长旺盛，营养袋吃料快，污染率低。对不同土壤理化性质进行检测，结果（表1）表明，石阡县土样全氮含量、全钾含量、pH值高于碧江区（P<0.05），全磷、有效磷、速效钾含量低于碧江区（P<0.05），2个样地试验组与对照组差异不显著。碧江区试验组碱解氮含量最高，明显高于对照组（P<0.05），而所有样品有机质差异不显著。

2.2 不同土壤样本中细菌、真菌物种多样性分析

对不同土壤样品细菌和真菌DNA进行抽提和测序，高通量分析后，获得8 613个细菌物种OTU，属于45个门和1 159个属，总序列数 1 572 726 条，各样本序列平均数38 989～49 520条，序列平均长度为407 bp；获得4 411个真菌物种OTU，属于16个门和780个属，总序列数2 503 140条，各样本序列数范围为66 151～76 349条，序列平均长度为 2 391 bp（表2）。由表2可知，碧江区土样细菌Shannon指数高于石阡县土样，ACE指数和Chao1指数差异不明显；真菌Shannon指数、ACE指数、Chao1指数则存在差异，碧江区对照组最高，试验组降低，与对照组差异明显（P<0.05），石阡县也低于对照组，差异不显著；碧江区土样ACE指数、Chao1指数高于石阡县，2个土样试验组与对照组差异不明显。结果表明，羊肚菌栽培前后细菌多样性和真菌多样性均降低，菌丝正常生长前后真菌变化显著，连作前后细菌和真菌多样性变化不明显，推测土壤中真菌多样性与羊肚菌菌丝长势有关。

2.3 不同土壤环境中微生物物种组成

2.3.1 细菌真菌门水平下物种相对丰度

由图1-a 可知，门水平下放线菌门、变形菌门、绿彎菌门、酸杆菌门为各土样土壤优势细菌门，以放线菌门占比最高，其4个优势门类相对丰度平均值分别为35.07%、21.83%、12.89%、11.39%，石阡县样地放线菌门丰度高于碧江区样地，碧江区试验组高于对照组。由图1-b可知，门水平下子囊菌门、担子菌、被孢霉门为各土样土壤优势真菌门，以子囊菌门占比最高，其3个优势门类相对丰度平均值分别为66.10%、20.62%、10.32%，石阡县（连作土壤）子囊菌门物种丰度减少，担子菌门、被孢霉门增加，碧江区（正常生长）羊肚菌样地3个优势真菌门物种丰度差异不明显。

由图2-a可知，在细菌主要属水平下共有35个属相对丰度>1%，其中，石阡县样地节杆菌属、鞘脂单胞菌属、类诺卡氏菌、Gaiella和Vicinamibacterales、Galellales中不能注释的属物种丰度占比较高，均>2%，以节杆菌属占比最高，对照组和试验组分别达到12.33%和13.90%；碧江区样地物种占比相对均匀，仅试验组节杆菌属占比较高（3.85%）。结果表明，2个样地中节杆菌属物种丰度差异大，连作土壤占比大，且播种羊肚菌后，节杆菌属占比有一定提高。由图2-b可知，在真菌属水平上共有33个属相对丰度>1%，石阡县样地中被孢霉属、头束霉属、青霉属物种丰度占比最大，可看出栽培羊肚菌后，被孢霉属丰度明显增加，头束霉属丰度则明显降低、青霉属丰度变化不大，羊肚菌属丰度差异不显著。碧江区样地中被孢霉属占比较大，栽培羊肚菌后丰度有所减少；试验组中羊肚菌属物种丰度占比最大（21.15%），因羊肚菌栽培第1年，故对照组未检测出羊肚菌属；青霉属物种丰度无明显变化。碧江区土样与对照组头束霉属丰度较低，差异不明显，但明显低于石阡县样地。

2.3.2 不同土壤环境真菌、细菌β多样性分析

对样品进行主坐标分析（PCoA），结果（图3）表明，4个分组细菌、真菌物种基本汇聚在一起，同样地对照组和试验组物种均有交叉，表明对照组和试验组间物种存在相似性，但栽培羊肚菌之后，样地中物种组成发生了变化，样本之间物种差异变大。2个样地细菌真菌相对独立汇聚在一起，样本间距离远，表明2个样地间物种组成差异大，且碧江区样地物种多样性差异大于石阡县样地。表明样地间物种多样性差异要大于组内物种多样性。

2.3.3 不同土壤环境主要真菌、细菌物种差异分析

对2个样地土壤细菌优势属进行组间差异分析，结果（图4-a）表明，不同处理间主要物种有显著或极显著差异（Kruskal-Wallis秩和检验，P<0.05，P<0.01），Top 10已知物种分别为节杆菌属、芽单胞菌属、小单孢菌属、溶杆菌属，其他物种暂不能注释，因此考察前3优势属物种在不同分组间的差异性。由图4-b、图4-d可知，石阡县试验组中节杆菌属、小单孢菌属丰度最高，明显高于碧江区样地物种丰度（P<0.01），略高于对照组，但不显著；由图 4-c 可知，碧江区试验组芽单胞菌属丰度明显高于石阡县样地（P<0.01），略高于对照组，但不显著。

对2个样地土壤真菌优势属进行组间差异分析，结果（图5-a）表明，不同处理间主要物种有显著或极显著差异（Kruskal-Wallis秩和检验，P<0.05，P<0.01），Top 10已知物种分别为被孢霉属、头束霉属、羊肚菌属、镰刀菌属、篮状菌属、毛壳属、Gibellulopsis、Albifimbria、芽枝霉属，1个种类暂无明确分类地位，因此考察前3优势属物种在不同分组间的差异性，由图5-b可知，石阡县试验组中被孢霉属丰度最高。由图5-d可知，石阡县对照组头束霉属丰度最高，两者明显高于碧江区样地物种丰度（P<0.01）；由图5-c可知，碧江区试验组羊肚菌属丰度明显高于石阡县样地（P<0.01）。

2.4 不同土壤环境微生物群落与土壤营养的相关性分析

考察土壤理化性质与土壤中微生物群落结构关系，为确定共线性较小的环境因子，分别对细菌物种和真菌物种进行方差膨胀因子（VIF）分析。基于筛选出的主要土壤营养因子进行RDA/CCA分析，结果（图6-a）表明，速效钾、有效磷、碱解氮、有机质与碧江区土样细菌群落组成呈正相关，pH值、全钾与石阡县土样细菌群落组成呈正相关。速效钾、有效磷、碱解氮、有机质之间呈正相关，与全磷、全钾呈负相关，以全钾对石阡县试验组细菌群落组成影响最大，以速效钾、有效磷对碧江区群落组成影响最大。由图6-b可知，全钾、pH值与石阡县对照组真菌群落组成呈正相关，速效钾、有效磷与碧江区试验组真菌群落组成呈正相关，有效磷、速效钾与全钾、pH值之间呈负相关，彼此之间呈负相关，以有效磷对碧江区真菌群落组成影响最大。

2.5 不同土壤环境中土壤微生物物种与土壤营养的相关性分析

由图7可知，不同样地中的理化性质指标均与相对基因丰度排名前10的细菌属有一定相关性，其中细菌属中速效钾与Vicinamibacterales无法注释的属呈正相关（P<0.01），相关系数为48.29%，有效磷与节杆菌属呈负相关（P<0.01）（图7-a），真菌属中有效磷与镰刀菌属、青霉属、篮状菌属，全钾与毛壳属、头束霉属均呈正相关（P<0.01，P<0.05），速效钾与毛壳属、沙蜥属，有效磷与被孢霉属、头束霉属呈负相关（P<0.01，P<0.05）（图7-b），其他理化性质与物种之间无相关性或呈弱相关性。结果表明，土壤中理化性质对物种丰度影响较小。

3 讨论与结论

土壤微生物多样性和外源微生物的种类和数量呈正相关［7，24］，本研究考察不同地区连作羊肚菌覆土层土壤，未栽培羊肚菌（对照组）和栽培羊肚菌（试验组）之间土壤理化性质和细菌真菌多样性变化情况。结果表明，碧江区试验组覆土层碱解氮明显增加，可能在于正常生长羊肚菌菌丝多，活力强，可转变土壤中氮素形态，增加效养分含量［25-26］。比较不同样地细菌、真菌多样性差异，细菌多样性高于真菌多样性，同一样地试验组和对照组细菌多样性差异不大。碧江区样地（正常生长）真菌多样性低于对照组，可能在于连作时本底微生物及理化性质抑制了羊肚菌菌丝生长，则真菌多样性变化不大，而羊肚菌菌丝正常生长，成为优势菌群，从而抑制了本底微生多样性，与前人研究［22，27］一致。对不同样地土壤微生物主要属水平物种进行分析，石阡县和碧江区样地差异较大，即地域之间物种差异性大于栽培前后差异性。连作土壤中细菌主要物种为节杆菌属，且对照组和试验组物种丰度分别达12.33%和13.90%。从2个样地栽培前后看，羊肚菌栽培后节杆菌属丰度均有一定程度的增加，表明羊肚菌栽培及连作可增加节杆菌属丰度，且是连作过程中的代表物种［28-29］。属水平下真菌物种主要有被孢霉属、头束霉属、羊肚菌属。针对被孢霉属物种丰度，石阡县样地明显高于碧江区，前者在连作后物种丰度增加，后者则有一定降低，但不明显。研究表明，头束霉属在羊肚菌原基退化时有明显丰度［21］，本研究发现连作土样中该物种占比很大，对其原基分化有明显影响，栽培结果表明石阡县土样在原基分化后无法正常生长，或衰退，或无法形成成熟子实体。Longley等发现，在羊肚菌菌絲生长和成熟时期，芽孢杆菌属、拟杆菌属、Gilmaniella是覆土层优势菌［21］，本研究则未发现这2个种类，与文献有差异。镰刀菌被认为是一类重要植物病原菌类群，具有随着栽植代数增加而显著增加的趋势［27，30］，本研究发现连作后镰刀菌丰度与对照物种丰度差异不明显，原因可能在于地区及土壤生态系统中物种的差异影响，有待进一步研究。而栽培羊肚菌，碧江区对照组镰刀菌属物种丰度明显降低，推测羊肚菌菌丝有抑制镰刀菌属真菌的作用，有待进一步研究验证。

本研究通过对不同地区和连作土壤理化性质、微生物（真菌、细菌）群落组成结构、多样性等特征进行分析，发现羊肚菌属物种丰度可转变土壤中氮素，提高碱解氮含量。不同土样细菌多样性高于真菌，连作土壤细菌、真菌多样性差异不显著，正常生长羊肚菌可降低真菌多样性。在门水平下，细菌优势物种为放线菌门、变形菌门、绿弯菌门，真菌优势物种为子囊菌门、担子菌门、被孢霉门。属水平下，细菌优势物种为节杆菌属、鞘脂单胞菌属；连作土壤中真菌优势属为被孢霉属、头束霉属、青霉属；碧江区样地为被孢霉属、羊肚菌属、青霉属。相关分析表明，全磷与节杆菌属呈负相关，与镰刀菌属呈正相关，全钾与头束霉属均呈正相关，全磷与被孢霉属、头束霉属呈负相关，各理化因子与羊肚菌属无明显相关性。

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收稿日期：2022-10-05

基金项目：贵州省科技计划项目（编号：黔科合支撑［2022］114、黔科合服企［2019］4007-6）。

作者简介：康 超（1987—），男，贵州仁怀人，硕士，高级工程师，从事食药用菌菌种繁育及栽培技术研究。E-mail：464286916@qq.com。