生态环境中抗生素耐药性检测及去除方法综述*

刘月环

(杭州医学院浙江省实验动物与安全性研究重点实验室,浙江 杭州 310013)

自1940年以来,人们已经发现了数百种抗生素并广泛用于疾病治疗、农业病虫害以及动物养殖行业。抗生素的发现极大提高了人类的健康水平,促进了社会生产效率[1]。研究表明,高达90%的抗生素不能被动物肠道完全吸收利用[2]2,大量抗生素以未曾改变的原始结构化合物和未完全代谢的中间产物形式进入自然环境,严重影响微生物群落结构的进化,进而影响生态环境健康[3]397。随着抗生素的过度使用,抗生素耐药性基因(ARGs)及耐药性细菌(ARB)作为新兴持久性污染物,在全球范围内以惊人的速度蔓延[4]。据测算,2050年全球由于ARB感染导致的经济损失将达到100万亿美元,细菌的抗生素耐药性已成为21世纪威胁人类健康的重要问题之一[5]。

为有效控制抗生素耐药性的危害,检测及去除生态环境中的抗生素耐药性已迫在眉睫。传统的抗生素耐药性检测方法以基于微生物培养的药敏性测试方法为主,随着分子生物学的发展,以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的分子生物学检测技术已广泛应用[6]2。此外,由于传统方法对于抗生素耐药性的去除效果有限,如何高效去除生态环境中的抗生素耐药性已经引起了学者的广泛关注[7]2,[8]18652。鉴于此,笔者对近年来国内外对于生态环境中抗生素耐药性检测方法及去除技术进行总结,旨在为生态环境中抗生素耐药性的进一步研究提供支持。

1 抗生素耐药性的检测方法

1.1 抗菌药物敏感性测试

抗菌药物敏感性测试方法是基于微生物的纯培养,用于检测单个细菌分离株对抗生素耐药性的体外实验方法,该类方法除了可确定细菌对待测药品的耐药性或敏感性之外,也可用于监测种群中耐药微生物的出现和传播[9]。常用的抗菌药物敏感性测试方法包括抑菌圈法、稀释法、抗生素浓度梯度法以及自动仪器法等[6]2-4,[8]18654-18655,上述测试方法的优缺点分析汇总见表1。

表1 抗菌药物敏感性测试方法Table 1 Test methods of antimicrobial susceptibility

抗菌药物敏感性测试方法获得的纯菌有助于更深层次地研究抗生素耐药性机制,可为抗生素耐药性的生理学及常规分子生物学检测提供基础,然而由于在人工条件下可培养的微生物种类有限,且该类方法对于实验室条件与人工操作的要求较高,限制了该方法在抗生素耐药性检测中的发展。

1.2 PCR技术

PCR技术已广泛应用于培养和检测混合环境样品中氨基糖苷、氯霉素、β-内酰胺、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、甲氧苄啶和万古霉素的特异性ARGs编码的耐药性[10]。然而,PCR技术的检测结果经常出现假阳性情况。将标记好的PCR产物作为脱氧核糖核酸(DNA)探针用于含有靶基因菌株的质粒或染色体DNA样本检测,可以避免PCR结果的假阳性[11]。为节省时间和精力,学者们研究出复合PCR方法并用于同时检测万古霉素、四环素、甲氧苄啶等的ARGs[12]。复合PCR技术通过在同一反应体中使用不同的引物对多个ARGs的DNA片段同时进行扩增,并借助凝胶电泳或添加不同的染料进行可视化检测。NETO等[13]利用多重PCR技术检测到红树林沉积物中的6株菌株均含有blaKPC-2基因。然而由于相同的反应条件会抑制部分DNA扩增,复合PCR会得到假阴性结果。此外反应体系中多对引物对之间形成的二聚体可能会干扰复合PCR的试验结果,从而降低灵敏度[14]。

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术通过PCR产物浓度随扩增周期的变化估算目标DNA初始浓度,通过荧光监测扩增反应确定ARGs的绝对丰度和相对丰度[15]。该技术常用的荧光试剂包括SYBR Green与TaqMan,用于检测tet、mef、erm、tetO、tetW、tetQ、vanA、mecA、ampC等ARGs[3]404,[16]。RT-qPCR技术具有高特异性、处理时间短、检出限(LOD)和定量限(LOQ)低等优点[17],但由于需要特异性引物设计,存在检测通量有限且成本较高等缺点,使得该技术成为一种使用较为困难的单一性检测方法,目前难以用于未知的ARGs的检测[18]。

高通量PCR(HT-qPCR)具有与RT-qPCR相同的准确性,与此同时,HT-qPCR打破了检测通量的限制,根据实验设备的不同,HT-qPCR可以同时测量同一样品中的数百种ARGs,从而在一次测试中覆盖更多抗生素种类[19]。LAI等[20]利用HT-qPCR分析了瑞典地表水供水系统的ARGs、移动元件以及其他基因的耐药性图谱,共检测到对11类抗生素产生耐药性的150个ARGs、7组整合酶移动元件在内的167个基因。但由于该方法仍是基于定量PCR技术,因此也存在与定量PCR相似的缺点,如检测前需要设计引物,无法提供宿主信息等。

微滴数字PCR(ddPCR)技术是一种相对新型的PCR技术,该技术将探针与核酸隔离在油乳剂的微滴之中,最终通过泊松分布确定阳性滴数和ARGs总浓度[21]。GINN等[22]基于ddPCR技术对玻利维亚拉巴斯气溶胶中的关键ARGs进行了检测与定量,发现其主要抗生素种类包括四环素、氟喹诺酮类和β-内酰胺类等。ddPCR技术无需运行标准曲线便能获得待测样本ARGs的相对丰度,且敏感度更高[2]5。然而,ddPCR技术也有与RT-qPCR相似的缺点,如检测通量有限,需要设计引物。

1.3 基因芯片技术

基因芯片技术又称DNA微阵列技术,是通过在单一检测中与参考菌株或基因进行比较,同时检测大量ARGs是否存在,从而提供关于分离物的详细信息的一种通量高、速度快、灵敏度高的基因组分析技术[23]。基因芯片技术已广泛应用于检测人类致病性大肠杆菌、幽门螺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等细菌,但使用该技术检测环境样品中ARGs的报道仍然较少。通过结合药敏性测试方法、PCR等技术,可有效提高基因芯片技术对环境中ARGs的检出水平[24]。BARTLEY等[25]1369-1377结合抗菌药物敏感性测试方法与基因芯片技术对比检测了巴西东北部某河流与俄亥俄州东北部下水道系统的ARGs,发现俄亥俄州东北部未经处理的污水中ARGs含量少于巴西东北部的湖泊。此外,由于基因芯片技术样品预处理较为复杂,且微阵列杂交芯片在实际的应用中会受到样品批间差异的影响,检测灵敏度和特异性相对较低,故对环境样品进行复杂的预处理是获得满意检测结果的必要和关键[25]1375。通过基因芯片技术可以提供细菌抗生素耐药性的详细描述,并可揭示出ARB表达随环境变化而发生的整体变化[26]。

1.4 基因组学

多项研究表明,全基因组测序(WGS)可以作为检测抗生素耐药性的主要工具。从测试样品中提取的全基因组DNA按软件程序组装,在过滤掉接头重复序列后用序列比对软件BLAST、USEARCH、DIAMOND等方法来拼接[27]358-359。通过WGS可以区分不同来源的耐药分离株,确定微生物的ARGs或耐药的机制,在由耐药微生物引起的疫情中确定和归因感染源,或通过ARGs的转移跟踪耐药微生物的传播[28]4。然而也有报道认为微生物不稳定的遗传特征(如临时基因扩增)导致其抗性的WGS鉴定不准确[29]。此外,由于样品收集方面缺乏标准化,样品中混入了非微生物来源的遗传物质及生物信息学软件使用不当均会直接干扰WGS的鉴定准确性,这使得难以将已识别的ARGs归因于特定菌株[28]18。

宏基因组测序也可用于检测和表征病原体及其耐药性的基因型,并且可以在不需要培养的情况下表征微生物群落[30]。采用该方法对整个群落的遗传物质进行测序,其结果的好坏取决于所选择的ARGs测序数据库,这些数据库包括SRST2、SEAR、ShortBRED、PATRIC、SSTAR、KmerResistance、GROOT、DeepArgs、Resfinder、ARG-ANNOT、RGI、ARGs-OAP(v2)、ARIBA、PointFinder和NCBI-AMRFinder等[27]361。宏基因组测序可以发现新的基因和新的微生物(包括不可培养的微生物),表征动物的天然微生物群,有效评估微生物的生态学及其在动物产品加工过程中的变化[31]。NAIDOO等[32]基于宏基因组方法对纳米布沙漠中受人为影响较小的土壤中的ARGs进行分析检测,并发现了β-内酰胺酶的存在。通过宏基因组测序,可以构建相对完善的宏基因组文库,捕获样本的系统发育树和遗传多样性。然而作为一种测序技术,宏基因组测序需要一系列的文库构建以满足分析所需的起始数据量的要求,对测序结果的解析也需要复杂的生物信息学工具,整体要求较高。

2 抗生素耐药性的去除

2.1 物理化学方法

2.1.1 吸 附

吸附过程涉及到包括离子交换、孔隙填充、电子相互作用、静电机制、表面络合和氢键互作在内的若干机制[33]。活性炭和生物炭具有丰富的表面官能团和较大的比表面积,作为一种高效、可持续的吸附剂,可用于消除各种水生环境中的致病微生物[34]。YE等[35]研究发现,施用生物炭后土壤中磺胺类化合物的浓度降低,土壤中生长的生菜根系中抗磺胺细菌内生菌减少,磺胺耗散增加。由于环境的影响,低成本、无毒的吸附剂通常会老化,为了改善其固有的物理化学特性或特定功能,研究人员通过设计不同的吸附剂以获得更好的吸附能力。WU等[36]提出了一种β-环糊精修饰的生物炭(β-BC)用于去除ARGs,在引入该生物炭后,总ARGs相对丰度大大降低。然而,吸附过程实质是污染物由一种介质转移到另一种介质的快速传质过程,其本质上并未使污染物完全消除或降解,而这种吸附法引起的含污染物吸附剂的处置也是个严重的问题。

2.1.2 混 凝

混凝技术通过将水中分散的混凝剂剧烈搅拌快速混合,使聚集的小颗粒絮凝成絮状体沉淀,可以携带的方式将ARGs从水中除去。GREHS等[37]研究表明,经过硫酸铝和丹宁混凝处理后,废水中细菌量和ARGs数量明显降低,其中硫酸铝的去除效果更好。对于混凝过程而言,溶液、混凝剂投加量、质量、pH、水的浊度、混凝时间、污染物的性质都是影响ARGs去除率的重要因素。近年来,关于混凝沉淀法去除ARGs和ARB的效果和机理的研究还比较少,是该领域未来研究方向之一。

2.1.3 消 毒

消毒技术通过在废水中加入消毒剂,杀灭、控制病原体和微生物的传播,从而抑制ARB的增殖和活动,减少废水中细菌的数量和病原体传播的风险。YUAN等[38]发现,氯化处理对红霉素ARGs或四环素ARGs的去除效果有限,其中约40%的红霉素ARGs和80%的四环素ARGs不能通过氯化处理去除。氯的消毒效率取决于氯的暴露情况[39]605,固定接触时间为15 min,当氯质量浓度达到30 mg/L时对抗生素耐药性去除效率可达90%以上[40],然而这在实际的工艺中很难实现。此外,有研究表明氯/氯胺消毒可能会增加ARB的相对丰度[39]605。

有研究表明,只有高剂量臭氧才能有效去除ARGs[41],然而臭氧剂量的提高往往伴随着致癌物质溴酸盐的产生[42]。此外,臭氧对微生物细胞的确切作用模式还不完全清楚。PATIL等[43]认为,在臭氧作用过程中细胞裂解不是微生物失活的主要机制。由于细胞修复酶的高活性,臭氧造成的细胞损伤可以修复[44]。因此对于抗生素耐药性在臭氧氧化过程中的降低机制和ARGs的损伤原因需要进一步探究。

紫外线(UV)是另一种常用的消毒方法,UV只作用于嘌呤和嘧啶,对细胞壁没有损伤[45]。研究表明,在典型UV消毒剂量下,耐磺胺甲恶唑和耐四环素ARGs的总丰度显著降低[46]。然而,现有的UV消毒方法对于抗生素耐药性的去除效果较为有限,甚至还会导致ARB相对丰度的增加,这可能是由于UV再激活[47]。

虽然现在已证实氯、臭氧、UV等消毒方法可有效去除ARB及ARGs,然而经过消毒处理后质粒中所携带的ARGs也可能被转移到其他细菌中,导致ARGs的繁殖,此外,细胞的诱导与修复机制还可能会使ARB对消毒过程产生抗性。

2.1.4 高级氧化技术(AOPs)

AOPs是利用羟基自由基(·OH)等活性氧氧化自由基降解水中各种污染物的技术。自由基能够破坏细胞表面和基因组DNA的结构,表明AOPs是灭活细菌细胞和消除ARGs的可行技术。各类AOPs的优缺点汇总见表2。

表2 AOPs的优缺点及适用性Table 2 The advantages,disadvantages and applicability of AOPs

在使用AOPs降低抗生素耐药性时,需要根据所处理水的类型与水质特性选取不同的处理技术;与此同时,在考虑运行成本的同时需要考虑ARGs与ARB的去除效率以及AOPs所带来的二次环境影响。

2.2 生物方法

2.2.1 活性污泥法

作为各类污水以及排泄物的集中处理地点,污水处理厂中的活性污泥与各类污水中的抗生素长期相互作用,诱发ARGs及ARB的产生,使其成为抗生素耐药性传播及储存的重要场所之一[7]2。研究表明,不同工艺对于抗生素耐药性的去除效果不同,相比于上流式厌氧污泥床(UASB)等工艺,膜生物反应器(MBR)和序批式活性污泥法(SBR)更能显著降低ARGs(如vanA、ereA、ampC、aacC1、tetA和sull)[48]。此外,污水中微生物的生物量是影响ARGs的主要因素,减少微生物的生物量可以有效提高ARGs的去除率[7]10。通过活性污泥宏基因组测序分析发现,变形菌门似乎是污水处理厂活性污泥中的优势菌属,芽孢杆菌属、诺心菌属和分枝杆菌属是ARGs最丰富的质粒载体[49],因此对可去除污染物的功能细菌与ARGs的关系进行深入探讨极为必要。此外,活性污泥的处理性能会受到抗生素抗菌作用的影响,这一点可能会增加污水处理厂的运行成本。而如何处置含有抗生素耐药性的活性污泥也成为了污水处理厂所要面临的重要问题,故需要对现有污水处理厂的相关处理技术进行升级,以满足其对ARGs等新型污染物的去除需求。

2.2.2 MBR

MBR是消除各种新兴污染物的常用方法,其处理过程涉及到吸附、生物降解以及膜分离机制。与其他污水处理工艺相比,MBR技术具有污泥停留时间(SRT)长、污泥产量少、混合液悬浮固体浓度高等优点[50]。LI等[51]研究对比了3种改良式MBR工艺和传统氧化沟工艺对于8种典型ARGs的处理效果,结果表明3种MBR工艺在处理ARGs方面均明显优于传统氧化沟工艺,对于废水中ARGs的去除最高可达到7.3个数量级。水力停留时间(HRT)是影响MBR技术去除抗生素耐药性的主要因素,通过优化HRT可有效提高抗生素耐药性去除的性能[7]8。膜污染是MBR的严重弊端之一,此外,抗生素耐药性的存在可以通过改变微生物群落和污泥颗粒、胞外聚合物(EPS)等其他污染因素来影响MBR的工作进程。

2.2.3 人工湿地

人工湿地技术是一种有效、可持续的水处理工艺,具有环境友好、成本低和易于操作等优点。人工湿地对ARGs的去除机制主要包括生物降解、底物吸附和植物吸收,其中,人工湿地系统中的植物通过向微生物群落输送氧气间接参与ARGs的去除,与此同时,系统中的基质为生物膜提供附着表面,也使得人工湿地系统去除微生物与降低ARGs丰度的能力有所增强[52]。NAS等[53]研究了人工湿地对抗生素及ARGs的去除效果,根据抗生素类型的不同,人工湿地对抗生素的降解率在28%～100%,对于ARGs的降解率达到了0.8～1.5个数量级。人工湿地去除ARGs的影响因素较多,包括湿地类型、基质类型、植物种类、水力加载速率(HLR)及进水水质等。研究表明,潜流型人工湿地对于抗生素耐药性的去除效果更优。此外,不同季节人工湿地对于抗生素耐药性的去除效果也不同,夏季和冬季ARGs去除率分别为59.5%和77.8%[54],故此还需对人工湿地降解ARGs的过程、机制、运行参数等进行深入的研究,以更好地满足实际需求。

2.2.4 好氧堆肥

好氧堆肥技术可显著降低畜禽粪便中ARGs的多样性和丰度,从而减少进入土壤中的抗生素耐药性[55]。堆肥条件和材料对ARGs的去除至关重要。LI等[56]研究表明,添加木屑和稻壳使得鸡粪中ARGs的去除率分别增加了35.4%和68.7%。堆肥温度升高或保温性是动物粪便ARGs减少的主要因素。此外,膨胀剂的多孔结构可能会扩大微生物之间的间隔,降低微生物之间的连通性,从而减少了耐药性水平转移的发生[57]。动物粪便和处理工艺的不同,会使动物粪便中ARGs的去除效率差异很大,建议通过工艺优化(主要是调节pH、温度、添加剂和C/N等),以对堆肥过程中一些潜在宿主菌的种群进行改变[58],进而提高堆肥对抗生素耐药性的去除性能。

2.2.5 厌氧消化

厌氧消化是能有效降低ARGs丰度的一种方法。LIU等[59]研究表明,当煤气化渣添加量为10 g/L时,厌氧消化后多种ARGs(包括dfrA7、sul2、tetW、ermF、ermQ)的去除率可达24.81%～90.48%,这些ARGs的变化可能受到厌氧消化过程中微生物群落演化的影响。然而,有研究表明,厌氧消化可以将某些类型的ARGs(如sul、fca等)的丰度增加52倍,这可能是由于操作温度的差异引起的[60]。优化厌氧消化的温度、固相停留时间等参数可以改变微生物群落结构,提高粪便中有机污染物的生物降解能力。在厌氧消化过程中,这些参数对于降低抗生素耐药性的影响机制还需要进一步探索。

2.3 新型材料与组合方法

传统物理化学方法对于ARGs及ARB的去除效果主要依赖于吸附剂、催化剂、混凝剂的选取,而材料的性质大大限制了此类方法的去除效果。新型材料的使用突破了传统方法的瓶颈,纳米材料等新型材料具有较大的比表面积,其物理和化学性质与粒径大小相关,可以有效提高吸附、氧化等过程的效率,此外新型材料也可以作为微生物或相关酶的固定化基质。纳米颗粒与抗生素联用对ARB/ARGs有较好的去除效果,其作用可能包括以下两种机制:一是功能化纳米材料与抗生素结合,进入ARB的细胞质,释放大量离子;二是抗生素和纳米材料在对抗ARGs方面的协同作用[61]。王艳雯[62]发现庆大霉素可以促进聚乙烯吡咯烷酮修饰的银纳米颗粒(Ag-PVP NPs)溶解释放大量银离子;同时,会增强Ag-PVP NPs与细菌的相互作用,提高细菌对银的摄取率。两方面的作用均会提升银的生物有效浓度,使联合体系产生协同抗菌作用。

然而,纳米颗粒的作用和应用仍存在争议,因为它们也可能诱发抗生素耐药性[63]。另外,纳米颗粒等一些新型材料可能具有生物毒性。因此,在对新型材料进行研制时,也需同时考虑其毒性、使用成本等相关因素。

除新型材料外,也可将多种工艺进行组合,通过工艺优势互补提高ARB和ARGs的去除效果。ZHOU等[64]对UV—活化过硫酸盐(UV/PS)工艺去除二次废水中ARB和ARGs的效果进行了研究,结果表明,UV/PS工艺对大环内酯类耐药菌(MRB)、磺胺类耐药菌(SRB)、四环素类耐药菌(TRB)和喹诺酮类耐药菌(QRB)的灭活率分别为96.6%、94.7%、98.0%和94.7%,ARGs的总量降低了3.84个数量级。

相比于单一工艺,组合方法对于降低抗生素耐药性的效果更为突出,然而其工艺过程以及机理机制更为复杂,具体工艺参数对结果的影响也更为显著。在对新技术进行研究时,除了考虑ARB和ARGs的去除效率及优化工艺条件外,还需深入探究协同作用下降低抗生素耐药性的具体机制。

3 总结与展望

传统实验室药敏测试方法所需时间较长,但由于其简便易用,仍是常用的抗生素耐药性检测方法之一。PCR方法在其成本与通量方面具有不可替代性,基因组学方法对于文库以及生物信息学工具要求较高,还需要进一步的深入研究。综合上述方法的优缺点,建议在未来的研究中一方面结合多种方法,优势互补,从多角度对抗生素耐药性进行检测表征,从而获得更加全面的结果;另一方面加快相应检测技术的开发与研究,建立完善的检测标准。

就抗生素耐药性的去除技术而言,一方面,ARGs与ARB的去除机制以及具体工艺参数研究还有待进一步加深;此外,单一去除方法的弊端已经越来越明显,物理化学方法可能会造成二次污染,且对于相应材料的要求越来越高,生物方法往往会受到抗生素耐药性机制的影响。故此,借助多种机制,结合各种新型材料,利用以生物方法为主的多技术协同对抗生素耐药性进行无害化去除将会是未来的研究热点。