利胆清胰汤通过调节Nf-κB信号通路对小鼠急性胰腺炎模型影响的研究

张强，樊钰莹，王立伟，刘倬希

1.牡丹江医学院临床学院，黑龙江牡丹江 157011；2.牡丹江医学院附属第二医院消化内科，黑龙江牡丹江 157011

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是一种常见的胰腺外分泌炎症性疾病，可导致严重腹痛和多器官功能障碍，还可能导致胰腺坏死和持续性器官衰竭，病死率为1%~5%，尽管以往进行了许多随机研究，对发病机制的理解有所进步，但仍没有特定的治疗方法[1]。缺乏针对AP的特异性治疗，破译其发病机制的分子机制可能有助于治疗干预。炎症的级联反应是促使急性胰腺炎由发病进展为急性重症胰腺炎的主要原因，是由TOLL样受体（toll like receptor, TLR）核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）激活和在腺泡细胞中产生的细胞因子启动的，在急性胰腺炎早期，NF-κB增加多种促炎基因的表达，增加血管通透性并诱发血栓形成和出血，最终导致组织坏死[2-3]，因此，减少NF-κB活化和促炎介质可能是减轻AP的良好治疗策略。利胆清胰汤是治疗急性胰腺炎之效方，体现疏肝利胆、泻热通腑法则，已证明其可以改善AP患者的胰腺和肠道损伤[4]，然而，利胆清胰汤对AP影响的确切机制尚未完全阐明。荟萃分析显示，利胆清胰汤可抑制NF-kB活性，从而抑制炎症因子释放并保护细胞免受损伤[5]。本研究2020年10月—2021年4月在牡丹江医学院临床学院对30只C57BL/6雄性小鼠进行实验研究，旨在探讨利胆清胰汤对雨蛙素重复腹腔注射诱导的小鼠急性胰腺炎模型的保护作用，以及对NF-κB通路的调控机制，为临床治疗提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性 C57BL/6小鼠（年龄：6周，体质量：15~20 g）购自实验动物研究中心。所有动物饲养在环境温度为（23±2）℃和12 h光照/12 h黑暗循环的气候控制室中。所有小鼠都喂食标准实验室食物，允许在标准条件下通过空气过滤随意饮水，并允许在诱导胰腺炎之前适应新环境7 d，将C57BL/6雄性小鼠30只随机分为正常组、模型组和利胆清胰汤组，每组10只，正常组小鼠体质量15~19 g，平均（18.44±3.22）g；模型组小鼠体质量15~20 g，平均（18.96±3.74）g；利胆清胰汤组小鼠体质量15~20 g，平均（18.84±3.56）g。3组小鼠一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经动物伦理委员会批准。

1.1.2 试剂与药物 茵陈、川芎、白芍、大黄各15 g，遏蓝菜、延胡索、守田、枳实各12 g，郁金、柴胡各10 g，芒硝、黄芩、陈皮、木香、红花各9 g，桃仁8 g，甘草、龙胆草各6 g。药品及熬制汤剂均由本院中药房提供。血清淀粉酶、髓过氧化物酶（myeloper‐oxidase, MPO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，苏木精、伊红和HEPES购自Sigma。针对NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3）、半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein, ASC）、磷酸化p65抗体购自Cell Signaling Technology，HRP标记羊抗鼠二抗购自 anta Cruz Biotechnology。

1.2 方法

C57BL/6雄性小鼠适应性喂养7 d后开始实验，正常组小鼠以等量生理盐水进行腹腔内注射，模型组和利胆清胰汤组小鼠按50 µg/kg,100 µl/（次·只）腹腔内注射雨蛙素，注射1次/h，共8次，利胆清胰汤组小鼠按照“人和动物按体表面积折算的等效剂量比值表”折算利胆清胰汤给药剂量，共分为3次给药，第1次给药是在第1次腹腔注射雨蛙素1 h后，第2次给药是在第8次腹腔注射雨蛙素1 h后，第3次给药在第8次腹腔注射雨蛙素24 h后，正常组和模型组小鼠灌服等量0.9%双蒸水溶液。观察模型组小鼠疼痛行为（舔/抬后爪和跳跃），于末次注射3 h后麻醉处死小鼠，之后立即收集胰腺和血液样本用于进一步检查。

1.3 观察指标

①疼痛行为观察：记录小鼠在30 s内疼痛行为（舔/抬后爪和跳跃）第一次出现时间。

②血清淀粉酶和髓过氧化物酶（MPO）活性：使用淀粉酶比色测定试剂盒（Sigma，St Louis，MO）测定血清的α-淀粉酶活性。

③组织病理学变化：小鼠胰腺在10%福尔马林中固定至少24 h，然后包埋在石蜡中。通过标准程序对约4 µm胰腺切片进行苏木精-伊红（H/E）染色处理。用于光学显微镜下的组织学检查。对代表每组至少100个视野的胰腺切片进行随机半定量评估。对胰腺进行了炎症（浸润性炎症细胞）和水肿（腺泡细胞分离）评分。每个测试都按照从0（正常）~3（严重）的等级评分。

④Nf-κB信号通路相关蛋白检测：免疫印迹法检测胰腺组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3），半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1），凋亡相关斑点样蛋白（ASC），磷酸化p65以及总p65蛋白。组织在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白质裂解缓冲液中匀浆。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白质样品（50 µg）通过还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后在4℃下转移到PVDF膜上过夜。膜在含5%脱脂牛奶的Tris 缓冲盐水中封闭，弃去封闭液加入NLRP3，Cas‐pase1、ASC、磷酸化p65、一抗进行杂交，于4℃反应过夜，随后与二抗HRP偶联的羊抗鼠IgG二抗一起孵育1h，化学发光显影，内参定量分析。

1.4 统计方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，采用F检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠疼痛行为第1次出现时间比较

与对照组小鼠相比，模型组小鼠疼痛行为第1次出现的时间明显缩短，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，利胆清胰汤组小鼠疼痛行为第1次出现的时间明显延长，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 各组小鼠疼痛行为第1次出现时间比较[(±s)，s]

注：*表示与对照组比较，P<0.05；#表示与模型组比较，P<0.05。

组别对照组（n=10）模型组（n=10）利胆清胰汤组（n=10）F值P值疼痛行为第一次出现的时间24.19±4.69（16.68±3.83）*（25.91±5.52）#10.766 0.002

2.2 各组小鼠血清淀粉酶、MPO水平比较

与对照组小鼠相比，模型组小鼠血清淀粉酶、MPO水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，利胆清胰汤组小鼠血清淀粉酶、MPO水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 各组小鼠血清淀粉酶、MPO水平比较(±s)

表2 各组小鼠血清淀粉酶、MPO水平比较(±s)

注：*表示与对照组比较，P<0.05；#表示与模型组比较，P<0.05。

组别对照组（n=10）模型组（n=10）利胆清胰汤组（n=10）F值P值血清淀粉酶（IU/L）265.41±78.96（1246.87±185.69）*（596.69±126.98）*#131.576<0.001 MPO（ng/mL）1.78±0.64（2.79±0.41）*（1.92±0.55）#10.206 0.003

2.3 各组小鼠胰腺组织病理评分比较

与对照组相比，模型组小鼠胰腺组织损伤明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，利胆清胰汤组小鼠胰腺组织损伤明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 各组小鼠胰腺组织病理评分比较[(±s)，分]

表3 各组小鼠胰腺组织病理评分比较[(±s)，分]

注：*表示与对照组比较，P<0.05；#表示与模型组比较，P<0.05。

组别对照组（n=10）模型组（n=10）利胆清胰汤组（n=10）F值P值水肿0.30±0.15（2.67±0.21）*（1.82±0.34）#237.371<0.001炎性细胞浸润0.25±0.22（2.71±0.24）*（2.00±0.33）#265.843<0.001

2.4 各组小鼠胰腺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB p65、NF-κB p65比较

与对照组相比，模型组小鼠胰腺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、p- NF-κB p65表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，利胆清胰汤组小鼠胰腺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB p65表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），但各组小鼠非磷酸化NF-kB-p65蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 各组小鼠胰腺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB p65、NF-κB p65比较(±s)

表4 各组小鼠胰腺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB p65、NF-κB p65比较(±s)

注：*表示与对照组比较，P<0.05；#表示与模型组比较，P<0.05。

组别对照组（n=10）模型组（n=10）利胆清胰汤组（n=10）F值P值NLRP3 0.62±0.10（1.47±0.15）*（0.99±0.12）#116.183<0.001 caspase-1 0.35±0.08（1.19±0.10）*（0.77±0.12）#171.818<0.001 ASC 0.28±0.06（1.89±0.26）*（0.92±0.10）#242.771<0.001 p-NF-κB p65 0.09±0.04（0.57±0.10）*（0.24±0.08）#100.500<0.001 NF-κB p65 0.48±0.09 0.50±0.08 0.49±0.10 0.122 0.886

3 讨论

AP的发病过程涉及多种因素[6-7]，目前准确的机制尚不清楚。有证据表明，促炎细胞因子是急性胰腺炎的介质，通过减少早期细胞因子的级联反应并改善疾病及其全身并发症，对于AP的治疗至关重要[8]。雨蛙素是胆囊收缩素的类似物，大剂量使用导致白细胞广泛浸润，淀粉酶产生过多，进而诱发AP的发生[9]。本研究结果表明，雨蛙素诱导的AP显示出更急性的胰腺炎模型，胰腺炎症恶化，血清细胞因子水平升高，以及剧烈的全身炎症反应。说明建模成功。利胆清胰汤是一种中草药制成的口服制剂，在AP患者中，能够缓解患者术后疼痛、减少炎症反应[10]，在实验性AP模型中，可以改善微循环障碍和胰腺、肠道的损伤[11]。本研究中通过利胆清胰汤可以明显改善雨蛙素诱导AP小鼠胰腺组织损伤，降低血清淀粉酶、MPO活性，缩短疼痛行为，可见，用利胆清胰汤可能是治疗AP的一种有效的药物。

NLRP3炎性小体介导了机体对微生物感染和细胞损伤的免疫应答，是多种疾病病理生理机制的重要组成部分。有研究发现，敲除NLRP3炎症体组分NLRP3、ASC、caspase-1基因，发现雨蛙素诱导AP的严重程度减轻[12-13]。王兵兵等[12]研究显示，与正常对照组NLRP3、ASC及caspase-1蛋白的相对表达水平分别为（0.62±0.11）、（0.15±0.04）、（0.37±0.05）比较，AP模型组显著升高[分别为（1.50±0.08）、（1.81±0.07）、（1.11±0.04）]（P<0.05）。本研究显示与正常对照组NLRP3、caspase-1及ASC蛋白的相对表达水平[分别为（0.62±0.10）、（0.35±0.08）、（0.28±0.06）]比较，雨蛙素诱导AP小鼠NLRP3、cas‐pase-1及ASC蛋白表达明显增加[分别为（1.47±0.15）、（1.19±0.10）、（1.89±0.26）]（P<0.05），这与以往研究一致，也说明NLRP3炎性小体通路参与AP发病过程，吴浪等[13]研究发现AP炎症过程伴随NF-κB依赖性抗凋亡基因转录激活，降低NF-κB活性和细胞因子水平，也可以抑制NLRP3炎性小体的激活，相关研究显示，与对照组p-NF-κB p65表达量（0.23±0.02）相比，雨蛙素诱导的AP模型小鼠p-NF-κB p65表达量（0.82±0.02）明显升高（P<0.05）[14]，本研究发现在AP小鼠中p-NF-κB p65表达明显升高，而NF-kB-p65表达无变化，这说明AP炎症过程伴随NF-κB通路被激活，而利胆清胰汤干预后p-NF-κB p65表达明显降低，并降低NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达，这说明利胆清胰汤可通过减少NF-κB的激活和阻断炎症因子来预防AP，从而共同降低AP的严重程度。

综上所述，利胆清胰汤通过调节抑制NF-κB通路与NLRP3炎性小体激活可减轻胰腺组织损伤，降低全身炎性反应。