小泛素化修饰调控糖尿病心肌病发生与发展

蔺 洁,雷 烨,李晓苗,周 洁

(1.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046;2.空军军医大学西京医院内分泌科, 陕西 西安 710032)

糖尿病严重危害人类健康,其患病人数不断上升,已成为21世纪威胁人类健康的主要慢性疾病之一。包括Framingham、UKPDS和MRFIT研究在内的许多流行病学研究表明,糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是心血管疾病的独立危险因素,特别是2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2DM)与心血管疾病的发病率和病死率密切相关[1-3]。心血管疾病是糖尿病最常见的并发症之一,据估计接近一半的糖尿病患者死于心血管事件[4]。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是一种特定形式的心脏病,独立于其他心脏危险因素,其典型临床特征包括早期的舒张功能障碍、随后出现以各种代谢和神经体液通路紊乱为特征的收缩功能障碍、心律失常、最终发展为心力衰竭[5]。目前关于DCM的具体发病机制尚未阐明,在临床上缺乏特异有效的临床诊治方法。糖尿病心肌病的病理生理机制复杂,包括高血糖、胰岛素抵抗、自噬、线粒体氧化应激、肾血管紧张素-醛固酮(RASS)系统的激活等。表观遗传(Epigenetics)是指在基因的DNA序列没有发生变化的情况下,对基因表达进行各种修饰,引起基因功能发生可遗传变化,最终导致表型变化。表观遗传主要包括DNA修饰、组蛋白修饰和翻译后修饰(Post translation modification,PTM)等,这些修饰使得DNA空间结构或染色质结构发生改变,基因沉默或过表达。研究发现很多心脏疾病都与表观遗传修饰相关,如糖尿病心肌中SERCA2a启动子区域的甲基化,导致SERCA2a表达降低从而发生DCM[6];多种翻译后修饰(PTMs),包括磷酸化和泛素化,控制NLRP3蛋白降解和炎症小体激活,导致心肌炎症发生等[7]。小泛素化修饰(Small ubiquitin-related modifier,SUMO)是一种类似于泛素化的翻译后修饰,通过靶向NLRP3炎症小体、参与氧化应激、影响线粒体功能、调节钙稳态等参与心脏疾病的发生发展。在此我们重点论述SUMO化在DCM中的作用,以及其在调节上述病理损伤过程中的内在联系。

1 SUMO化是一种翻译后修饰

蛋白质翻译后修饰,通过对蛋白质的各种生物功能以及生理性刺激做出及时的响应及精密调控,极大的丰富了蛋白的多样性和生物活性。泛素化是一种很常见的翻译后修饰,涉及到76个氨基酸的泛素与其他蛋白质的赖氨酸残基结合。这种修饰按E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶的顺序作用催化[8]。去泛素化则是由去泛素化酶(DUBs)催化,主要参与蛋白质降解、信号转导和亚细胞定位[9]。SUMO化是一种10 kDa左右的类似于泛素化的蛋白质翻译后修饰,主要影响蛋白质的稳定性、调控细胞分裂、DNA复制修复、信号转导和细胞代谢等多种生物过程[10]。

SUMO蛋白是一个保守的真核蛋白修饰家族,大约有100个氨基酸,目前已经鉴定了五种亚型,分别是SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4和SUMO5[11]。SUMO1和SUMO2、SUMO3在体内广泛分布,而SUMO4和SUMO5似乎具有组织特异性,但研究较少。SUMO4 (M55V)与1型糖尿病(Type 1 diabetes,T1DM)和T2DM的发展高度相关[12]。SUMO5是新近发现的家族成员,对灵长类动物的研究发现,SUMO5具有很高的组织特异性,参与早幼粒细胞白血病核小体的调控。从一级结构上看,SUMO1与SUMO2和SUMO3的序列同源性为46%,而SUMO2和SUMO3的序列同源性为97%[13]。SUMO化同泛素化一样通过多步骤的酶级联反应可逆地吸附在赖氨酸残基上,这一过程由E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶催化,目前所检测的生物体只含有一种E1(SAE1/SAE2)酶和E2(UBC9)酶,但含有多种E3酶[14]。E1酶利用ATP水解将成熟的SUMO蛋白与其活性位点的半胱氨酸共价连接,随后将SUMO蛋白转移到E2酶的活性位点上。在E3酶的帮助下,E2酶进一步将SUMO蛋白转移到靶蛋白上,最终使靶蛋白发生SUMO化。SUMO化修饰是一种动态可逆的过程,SUMO特异性蛋白酶家族(SUMO-specificproteases,SENPs)是去SUMO化过程中的关键酶,主要催化去除靶蛋白上的SUMO蛋白。目前共发现6种SENPs,即SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6和SENP7,其中SENP1主要分布在细胞核的核体,SENP2分布在核孔,SENP3和SENP5分布在核仁,而SENP6和SENP7主要分布在胞质。不同的SENP成员靶向特定的SUMO化蛋白[15]。在人体生理状态下,SUMO修饰通过SUMO化和去SUMO化保持动态平衡。当SUMO化和去SUMO化的动态平衡被破坏后,细胞的某些功能被破坏,从而促进疾病的发生发展。

2 SUMO蛋白在DCM中的作用

《Nature》《Circulation Research》等著名杂志都曾发文指出SUMO化修饰对于维持心肌细胞的生理功能具有非常重要的作用[16]。SUMO化修饰减少见于多种心脏病,包括心肌缺血、心衰等,恢复SUMO化修饰可能不同程度的改善心脏形态学变化和功能下降。但是研究发现SUMO不同及相同亚型的修饰在心脏中发挥着不同的作用,例如心肌特异性过表达SUMO1的转基因小鼠可抑制压力过度诱导的心肌肥厚和功能障碍,而心脏特异性过表达SUMO2的小鼠表现为剂量依赖性心肌肥厚和功能障碍[17-18]。但也有研究表明,SUMO2、SUMO3介导的动态蛋白1 (Dynamic protein 1,DRP1)的SUMO化也可以保护心功能[19]。这不能简单解释为SUMO1、SUMO2和SUMO3的基因表达差异,可能与它们的诱导方式不同有关。不同的诱导方式对应不同的靶蛋白,从而表现出对心功能的不同影响。高糖环境是否会诱导心肌细胞内的SUMO修饰发生异常变化,以及哪些分子可能参与其中从而影响心肌细胞功能我们将进一步论述。

2.1 ERK5- SUMO化在DCM中的作用 细胞外信号调节激酶5(Extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)是心肌发生SUMO化修饰的主要靶点之一。在糖尿病心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)动物模型中,ERK5被SUMO2、SUMO3高度修饰[10,20],同时ERK5可被SENP2催化发生去SUMO化。有研究者将心肌细胞暴露于H2O2或高糖后观察到ERK5-SUMO化修饰增加,而ERK5的转录活性明显下降,突变ERK5的K6R/K22R位点后,ERK5转录活性升高,降低了ROS介导的心肌细胞凋亡,改善了心功能,提示K6R/K22R是ERK5的SUMO化位点[20]。糖尿病心肌梗死小鼠模型中过表达MEK5α后ERK5-SUMO化被抑制从而在转录水平上激活ERK5,另外PDE3A-ICER反馈环诱导心肌细胞凋亡也被抑制。因此高糖或H2O2诱导的心肌细胞的凋亡可能与ERK5-SUMO化修饰增加,影响PDE3A-ICER反馈环路有关。

2.2 Nrf2-SUMO化参与DCM氧化应激 核转录因子Nrf2[nuclear factor erythoid 2(NF-E2)related factor 2]调控多种编码抗氧化与解毒作用相关靶基因的表达,在细胞核内与靶基因启动子中的抗氧化反应元件(ARE)结合后,抵抗氧化应激,维持细胞稳态。Nrf2的一种胞质阻遏蛋白Keap1与Nrf2在细胞质中结合,阻止Nrf2的核易位,Nrf2与Keap1解耦联后被激活。另外p62作为Keap1的特异性自噬受体与Keap1结合后,将其与其他泛素化蛋白聚合体嵌入降解,释放并激活Nrf2[21]。 正常状态下,Nrf2-Keap1-P62的回路处于动态稳定状态,维持细胞氧化还原稳态,一旦进入糖尿病状态,受损的内部环境产生过多的活性氧(ROS),导致p62依赖性的Nrf2激活延长,心肌细胞发生过度自噬,降解更多的p62-Keap1复合物,反馈影响Nrf2核易位,抑制Nrf2的激活,导致心肌细胞凋亡,引起心肌功能障碍[22]。

SUMO化参与调节Nrf2抗氧化应激。在肝癌细胞中SUMO1与Nrf2结合后Nrf2的抗氧化应激能力提高,而突变Nrf2的K110位点后,Nrf2的稳定性被破坏,ROS的水平升高,说明K110位点是Nrf2的SUMO化位点。另外去SUMO化酶SENP1的敲低可上调Nrf2的SUMO1修饰,提高了Nrf2的稳定性。SUMO-E2结合酶Ubc9是发生SUMO化修饰必不可少的酶。通过这一点,有研究者发现Ubc9的缺失导致胰腺β细胞中Nrf2赖氨酸残基K525和K595缺乏SUMO化,使Nrf2介导的抗氧化应激保护缺失,继而导致小鼠发生严重糖尿病[23]。有趣的是,SUMO-E3连接酶RNF4在PML-NBs中与Nrf2结合导致Nrf2降解[24]。虽然目前对于Nrf2-SUMO化修饰在心肌中研究很少,但是SUMO化在调节Nrf2抗氧化应激发挥的作用毋庸置疑。

2.3 DCM中SUMO化介导的线粒体应激反应 众所周知,线粒体在生物体能量代谢中至关重要。线粒体通过氧化葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等小分子物质产生能量,同时线粒体代谢产生的中间产物可作为合成代谢和调节细胞活性的信号分子的原料[25]。越来越多的研究证实线粒体代谢和功能是由细胞外环境的改变触发的[26-28]。线粒体对细胞外环境各因素的反应称为线粒体应激反应。

SUMO化修饰是一个应激诱导的过程。许多有关SUMO化的研究表明,它在真核生物的应激反应中起着至关重要的作用[29]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)共激活因子1α (PGC-1α)作为线粒体生物发生的主调控因子,可激活转录因子表达,进而调节线粒体生物发生和呼吸[30]。有证据表明,PGC-1α可以在K183位点上被SUMO化,负性调控PPARγ-依赖的转录功能[31- 32]。更重要的是SENP1介导的PGC-1α去SUMO化增强了线粒体的生物发生和功能[33]。在T2DM中高血糖和脂肪酸氧化失衡诱导产生过多AGEs、ROS触发线粒体应激,导致线粒体融合和裂变之间的转换失衡。在线粒体融合和裂变的调节中,SUMO化已被证明参与调节线粒体动力学。DRP1是线粒体裂变的关键调控因子[34]。 最近的一项研究表明,DRP1是SUMO修饰的直接靶标,SUMO结合酶UBC9与DRP1之间的相互作用控制着DRP1的定位,阻止正常的线粒体裂变[35]。Harder等进一步确定UBC9和SUMO1是DRP1的特异性相互作用蛋白,他们发现SUMO1通过抑制DRP1的溶酶体降解稳定内源性DRP1。Zunino等发现,SENP5缺失增加了ROS的产生,促进了线粒体碎裂。相反,SENP5过表达抑制DRP1的SUMO化,从而挽救线粒体裂变,抑制线粒体应激。SUMO2/3修饰抑制DRP1从细胞质向线粒体转位,从而保护心功能,而心肌细胞特异性过表达SENP5可抑制DRP1的SUMO2/3修饰,继而诱导心肌细胞凋亡[36]。综上可见SUMO修饰在心肌细胞线粒体融合和裂解的转换中发挥着至关重要的作用。

2.4 DCM中SUMO化与炎症

2.4.1 SUMO化靶向调控NLRP3炎症小体:不受控制的NLRP3炎症小体激活是慢性炎症疾病的基础。DCM以慢性低度炎症为特症[37]。大量研究表明NLRP3炎症小体参与DCM的发病和进展[38];高糖状态下激活NLRP3炎症小体促进心肌细胞大量分泌白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-18等促炎细胞因子,加重心肌细胞血糖不耐受和胰岛素抵抗[39]。心肌细胞是终末分化细胞,心肌细胞死亡是DCM进展中的一个致命分子事件,抑制心肌细胞中NLRP3炎症小体可以降低高糖条件下Caspase-1和IL-1β的蛋白表达,降低心肌细胞的病死率。因此抑制NLRP3炎症小体对于改善DCM患者的心功能非常重要。有研究证明SUMO的结合可负向调节NLRP3炎症小体,在稳态条件下NLRP3与SUMO- E3连接酶MAPL连接并被SUMO化,激活NLRP3炎症小体后,NLRP3和MAPL之间的相互作用被破坏,NLRP3被去SUMO化。去SUMO化酶SENP6和SENP7也可选择性抑制NLRP3-SUMO化从而促进半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)激活和IL-1β的产生。由于NLRP3炎症小体在许多炎性疾病中发挥关键作用,因此识别调节NLRP3的SUMO化、去SUMO化平衡是炎症领域具有治疗潜力的重要进展。深入研究NLRP3-SUMO化将为DCM提供新的诊疗策略。

2.4.2 核因子κB(NF-κB)是DCM的炎症调节因子和SUMO化靶点:核受体NF-κB是调节炎症反应的中心环节。在非活性状态下,NF-κB与κB抑制剂(IκB)结合存在于细胞质中。当IκB激酶(IκK)被炎症因子刺激时,NF-κB活化。由此产生的游离NF-κB转位到细胞核并反式激活促炎基因。近期研究表明, NF-κB参与调节DCM的炎症反应。在心脏中高血糖激活NF-κB信号通路性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18、 TNF-α和TGF-β1的表达,诱导心肌细胞肥大,促进心肌纤维化。

NF-κB自身是否发生SUMO化修饰,目前尚无足够的证据支持,但是SUMO化及其相关酶对NF-κB以及下游基因的调控在DCM中发挥着重要的作用。IκK是两个激酶IκKα和IκKβ的复合物,其亚基称为NF-κB必要调制器(NEMO)。NEMO不具有催化活性,但对IκK的激活和IκB的磷酸化至关重要。敲除NEMO可阻止IκK有效磷酸化IκB并激活NF-κB信号通路。最近有报道称,SUMO1在Ubc9的催化作用下与IκBα的K21和K22位点结合抑制其泛素化而不被破坏,阻断与NF-κB的分离,从而抑制并下调NF-κB的活化。相比之下,SUMO2和SUMO3在高糖条件下与IκBα结合导致IκBα降解并激活NF-κB通路。另外,SUMO1与NEMO结合后激活NF-κB。SENP2是NF-κB的下游转录靶点,它与NEMO结合导致NEMO去SUMO化抑制NF-κB的激活。

2.5 SUMO化修饰在肌浆网Ca2+ATP酶2a ( Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca ATPase 2a,SERCA2a)功能中的作用 DCM的主要特征是舒张和收缩功能障碍,而钙离子(Ca2+)循环在心肌细胞的收缩和舒张中起着至关重要的作用。肌浆网(Sarcoplasmic reticulum,SR)作为一个储存Ca2+的细胞器,在心肌收缩和舒张期间介导Ca2+的释放和再摄取。SERCA2a作为心脏中表达的SERCA的一种亚型,介导心肌细胞的收缩和细胞质中的Ca2+重新进入SR。SERCA2a的活性调节控制心肌的收缩和舒张影响心功能。SERCA2a在衰竭心脏中的表达和活性降低,而通过增加心肌中SERCA2a表达的基因治疗已经被证明是有效的。相关研究发现SERCA2a可以被SUMO1在赖氨酸480和585位点修饰从而提高其酶活性和蛋白质稳定性[16]。在人类衰竭心脏中,SUMO1蛋白和SERCA2a-SUMO化的水平显著降低。而相关动物实验表明,小鼠心肌特异性过表达SUMO1后,SERCA2a的活性明显升高,心衰后心功能得到明显改善。同时SUMO1过表达阻断了H2O2对心肌细胞SERCA2a活性的负面影响,从而降低体内氧化应激指标。这些研究表明,靶向SERCA2a-SUMO化是治疗DCM心衰的一个潜在方法。

3 小 结

经过几十年的研究,SUMO化已被证明是一个主要的翻译后蛋白修饰系统,涉及包括调节蛋白质相互作用、蛋白降解、调控转录活性、拮抗泛素化、亚细胞定位等细胞生物学的各个方面。尽管与泛素化途径相比,SUMO化和去SUMO化途径的生物化学结构简单,但通过与其他生化途径如泛素化、磷酸化和乙酰化的相互作用,SUMO化和去SUMO化能够实现许多生物功能。在糖尿病心肌中,ERK5-SUMO 化修饰影响ERK5的转录活性,调控心肌细胞凋亡。SUMO化还通过调节Nrf2抗氧化应激参与糖尿病的发生。另外SUMO蛋白靶向NLRP3炎症小体、NF-κB通路相关蛋白调节糖尿病心肌炎症。心肌Ca2+是心肌收缩的关键,活性的SERCA2a调节控制心肌Ca2+的转运,而SERCA2a- SUMO化可以提高其酶活性和蛋白质稳定性,改善心衰后心功能。除了以上分子的SUMO化修饰参与糖尿病心肌损伤外,还有许多分子的SUMO化修饰参与各类心脏疾病的发生发展,例如:p53、蛋白激酶C(PKC)的SUMO化与动脉粥样硬化的进展相关;GATA4-6、肌细胞增强因子2(MEF2)、大鼠心脏特异性同源盒转录因子NKX2.5(NKX2-5)、血清反应因子(SRF)、T-box转录因子2(TBX2)和TBX5的SUMO化修饰在心脏发育中起着关键作用;组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)、缺氧诱导因子1α(HIF1α)的SUMO化参与缺血性心肌病的发展。SUMO化作为未来DCM治疗最有潜力的靶标之一,虽然对其研究取得了重大进展,但仍有许多问题待解决,例如SUMO化修饰与其他修饰是怎么相互作用的;在SUMO化修饰过程中靶蛋白如何选择SUMO亚型;SUMO化修饰途径中各组分的表达通过什么途径控制以及各种酶类又是如何发挥作用的。未来对SUMO化修饰的深入研究,这些问题将会得到解决,从而为各类疾病治疗提供新的策略。